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目的：根据诊断标准收集FH患者;根据前期调查的国际最新全基因组关联研究(GWAS)结果,95个与胆固醇代谢相关的基因(位点),结合胆酸代谢过程中的基因,设计靶向外显子捕获芯片进行外显子富集并结合二代测序结合建立新的检测方法,检测已经明确基因诊断的FH患者外周血DNA验证该芯片的可靠性;进而对未检测到基因突变的患者进行检测,采用传统测序在家系成员中验证,生物信息学明确导致胆固醇水平增高的可能的分子机制.对筛查过程中未见报道的特殊突变进行体外细胞学实验探讨突变对胆固醇代谢的影响,探讨该患者高胆固醇血症的遗传机制.为了解汉族FH患者的遗传背景提供依据.
方法：1.查阅国际最新的GWAS结果95个与胆固醇代谢相关的基因(位点),结合胆酸代谢过程中的基因,通过巧妙设计简化筛选范围,建立胆固醇和胆酸代谢相关基因的靶向外显子捕获芯片;2.收集40例患者的病史,进行体格和生化指标检查;3.入选10例已知基因诊断的FH杂合患者,提取10例患者的DNA;应用靶向外显子捕获及测序并生物信息学分析筛选致病基因,验证芯片和测序平台的可靠性;4.入选15例纯合表型但常规方法未检测出基因突变的患者和15例新入组的纯合患者;提取30例患者的DNA,应用靶向外显子捕获及测序筛选已知和未知致病基因,经生物信息学分析和家系内验证明确未知基因突变,检验芯片发现未知突变的能力;5.对发现新突变的先证者进行核心家系验证,明确突变来源;6.对捕获测序的SNP进行综合分析,明确中国汉族人群与血脂水平密切相关的基因;7.结合正常人测序数据及患者本身的血脂水平筛选汉族FH人群的易感SNP;8.抽取新突变患者静脉血,流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞的受体功能,验证新突变是否为致病性突变;9.对1例新突变江苏汉族FH家系先证者进行病史询问、心电图、眼底检查、周围血管及心脏超声、核素心肌灌注显像检查,10.结合家系成员发病情况分析结果,根据陈再嘉主编的《临床冠心病学》和美国诊断标准明确临床诊断,初步确定遗传模式。
结果：1.设计靶向捕获芯片仅包含167个基因,大大缩小了筛选范围;2.入选患者均符合家族性高胆固醇血症诊断,排除继发性高脂血症,部分患者有皮肤黄色瘤;3.靶向外显子捕获测序方法可以100％筛选出10例已知基因诊断患者的突变基因及位点,检测出已知突变基因和位点,证明靶向外显子捕获测序芯片及平台可靠;4.靶向外显子捕获测序方法在30例未检测出基因突变的患者中发现C356G新的LDLR基因突变位点,证明该技术不仅可检测出已知突变,也可以检测出未知突变;5.去除已知基因后中国汉族人群与血脂水平密切相关的Top10基因分别为PLEC、TYW1B、LACTB、LILRA3、MLXIPL、TRPS1、LPA、HPR、ARHGEF10L和IRS16.核苷酸序列分析发现:江苏Ⅰ号家系先证者LDL-R基因第8外显子(E8) C356G杂合新突变,遗传于母亲;核心家系成员测序验证发现先证者父亲存在另一杂合突变(E9)I402T;7.结合正常人测序数据及患者的血脂水平,发现11个与血脂密切相关的SNP;8.流式细胞仪检测患者的突变蛋白受体功能发现,突变受体的内化和结合LDL的功能受损分别为正常人47％和32％;9.先证者的高脂血症为遗传所得,心电图未见明显缺血改变,周围血管超声未见斑块,超声心动图可见结构性异常改变,10.江苏Ⅰ号家系先证者胆固醇和低密度脂蛋白水平极度增高,分别为24.65mmol/L和15.00mmol/L,合并多发性皮肤黄色瘤表现,可诊断为重症FH纯合子患者;江苏Ⅰ号家系11名成员中有7人可诊断为FH杂合子患者;家系具有常染色体显性遗传模式;
结论：1.靶向外显子捕获测序方法是一种快速、准确、高效的筛查FH突变的方法,费用低廉适合中国临床及科研应用.2.捕获测序不仅可诊断已知突变位点,也可以诊断未知突变位点,及大量的SNP信息,这些微效基因可以解释无主效基因突变患者的发病机制;2.家族性高胆固醇血症是一种复杂的多基因疾病,主效和微效基因突变均可引起该病;4.江苏Ⅰ号先证者存在LDL-R基因C356G杂合突变,在国内外未见报道,为新致病突变;5.流式细胞检测证实LDLR新突变位点C356G为致病性突变位点.