【摘 要】
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目的：克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5侧翼区和3侧翼区序列,并对其进行功能分析。
方法：构建盐藻基因组步行文库,采用LA-PCR方法,从盐藻步行基因组文库中扩增NR基因5上
【机 构】
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郑州大学细胞生物学研究室郑州大学第一附属医院郑州450052
【出 处】
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2006年全国博士生学术论坛——中国生物多样性分论坛
论文部分内容阅读
目的：克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5侧翼区和3侧翼区序列,并对其进行功能分析。
方法：构建盐藻基因组步行文库,采用LA-PCR方法,从盐藻步行基因组文库中扩增NR基因5上游区序列。采用普通PCR方法扩增NR3侧翼区序列。利用SOEing法扩增含5侧翼区和EGFP的融合片段,顺序与3侧翼区连接后,构建含5侧翼区-EGFP-3侧翼区表达盒的表达载体。电击法转化盐藻细胞,观察不同氮源培养条件下报告基因的表达。
结果：硝酸盐能诱导NR的最大表达,铵能启动NR的低转录,但却完全抑制NR的活性.从盐藻基因组中分别中扩增出约1200bp5侧翼区序列和913bp的3侧翼区序列.序列分析表明,5侧翼区含有启动子的特征性序列,含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box and GAGA-box)以及与转录因子结合位点相似的核苷酸序列。3侧翼区序列含有两个特征性的加尾信号序列,符合终止子的序列特征。将所构建的重组载体转化盐藻,通过荧光显微镜在400纳米的蓝光激发下观察,转化藻株可见有游动的发绿光的藻细胞,而对照株无带荧光的活细胞存在，并且硝酸盐能诱导GFP的表达,铵抑制其表达。
结论：所克隆的盐藻NR基因5侧翼区和3侧翼区可能是一种具有开关活性的可控性启动子和终止子.
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