【摘 要】
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2010年10月,作者实验室在陕西渭南大棚中发现疑似双生病毒侵染症状的番茄植株。将田间发病植株带回实验室进行分子检测。提取总DNA后采用双生病毒通用引物对PA和PB进行PCR扩增
【机 构】
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西北农林科技大学植保学院 旱区作物逆境生物学国家重点实验室 植保资源与病虫害治理教育部重点实验室,杨凌712100
【出 处】
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中国植物病理学会2011年学术年会
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2010年10月,作者实验室在陕西渭南大棚中发现疑似双生病毒侵染症状的番茄植株。将田间发病植株带回实验室进行分子检测。提取总DNA后采用双生病毒通用引物对PA和PB进行PCR扩增。结果表明,与阴性对照比较,发病植株中均可扩增得到长约500bp的特异性条带。对该条带进行序列测定后,设计用于扩增近全长DNA-A的引物对TYLCV1和TYLCV2。采用引物对TYLCV1/2从田间发病植株中扩增得到2.7kb左右的特异性条带。序列测定表明,陕西渭南田间发病植株中DNA-A全长2781bp。我国的TYLCV分离物属于单组分双生病毒,而且伴随有卫星分子-DNA-β。然而,采用DNA-β的通用引物对DNAβ01和DNA-β02,在检测到DNA-A的同一发病植株中,随经多次尝试,仍未能扩增到DNA-B的特异性片段。可以推测在陕西渭南的TYLCV分离物中不含有DNA-β片段。以DNA-A序列为模板,进一步设计了两套LAMP扩增引物对。以含有目标片段的质粒为正对照,以超纯水为负对照,分别对田间样品提取总DNA后进行LAMP检测,LAMP扩增结束后加入SYBR Green Ⅰ作为指示剂进行观察。结果表明,在白光下目测可见阳性对照及感病植株样品表现出明显的翠绿色,而负对照则表现为红褐色。在紫外光下,阳性样品表现出明显的绿色荧光,而阴性样品则无荧光表现。电泳检测表明,阳性样品出现了多条ladder状条带,而阴性样品则没有明显的条带表现。进一步检测扩增灵敏度发现,与PCR扩增结果比对,LAMP扩增体系的灵敏度要比PCR体系高出100倍左右。
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