【摘 要】
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目的 研究苯并[a]芘(BaP)诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化过程对DNA甲基化转移酶(DNMT)表达水平及活性的影响,为进一步阐明BaP致癌的分子机制提供实验依据.方法 以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(polβ+/+)和20 μmol·L-1的BaP(经S9活化)长期多次染毒构建的小鼠胚胎成纤维恶性转化细胞(polβ-T)为研究对象,以gadph作为内参,采用RT-PCR检测两种细胞中dnmts(
【机 构】
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四川大学华西公共卫生学院,四川成都610041
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目的 研究苯并[a]芘(BaP)诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化过程对DNA甲基化转移酶(DNMT)表达水平及活性的影响,为进一步阐明BaP致癌的分子机制提供实验依据.方法 以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(polβ+/+)和20 μmol·L-1的BaP(经S9活化)长期多次染毒构建的小鼠胚胎成纤维恶性转化细胞(polβ-T)为研究对象,以gadph作为内参,采用RT-PCR检测两种细胞中dnmts(dnmt1,dnmt3a和dnmt3b)的mRNA水平；以15 ku的组蛋白H2AFX为内参,用Western蛋白质印迹方法检测细胞中DNMT(DNMT1,DNMT3a和DNMT3b)的蛋白表达水平,同时用DNA甲基转移酶活性/抑制分析试剂盒检测DNMT的酶活性.结果 polβ-T经转化灶形态观察、细胞迁移实验、软琼脂克隆等实验鉴定,表明polβ-T细胞已具备典型的恶性转化细胞特征.RT-PCR结果显示,polβ-T细胞dnmt1和dnmt3b的mRNA相对表达量分别为0.940±0.033和0.905±0.062,均高于pol β+/+细胞(0.560±0.031和0.666±0.041),差异有统计学意义(P＜0.05),两种细胞dnmt3a mRNA相对表达量的差异不明显,无统计学意义；Western蛋白质印迹结果显示,pol β-T细胞DNMT1和DNMT3b的蛋白相对表达量分别为2.172±0.089和1.134±0.144,亦均高于polβ+/+细胞(1.311±0.050和0.820±0.106),差异具有统计学意义(P＜0.05),两种细胞DNMT3a的蛋白相对表达水平均无显著性差异；酶活性检测结果显示,pol β-T细胞和polβ+/+细胞A值分别为1.45 ±0.08和1.92 ±0.13,pol β-T细胞中DNMT酶活性[(234 ±23)mg-1 ·h-1]较polβ+/+细胞中DNMT酶活性[(318 ±42)mg-1·h-1]明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 BaP可能通过诱导肿瘤相关基因甲基化水平的异常,增加基因组的不稳定性,促进肿瘤的发生发展.
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