论文部分内容阅读
[目的]评价皮肤致敏性的小鼠局部淋巴结分析(LLNA)实验由于要使用放射性元素,其应用和推广受到很大限制,此外可能会出现假阳性结果.本研究开展应用流式细胞术的LLNA实验,筛选与皮肤致敏相关的标志物；并用EdU代替BrdU,对BrdU-ELISA方法进行改进研究.另外建立一种皮肤致敏体外评价方法,即骨髓U937细胞皮肤致敏试验(MUSST),并进行初步方法验证.[材料和方法]1.LLNA方法改进研究：使用8周龄雌性CBA/J小鼠,建立不同强度的皮肤致敏模型(PB、HCA、PPD、DNCB、(MI)5)及刺激剂SLS模型,对动物双耳背部连续涂药3天,第5天腹腔注射EdU,在注射后4、7、24小时分别处死动物(多模型实验中仅在7小时),摘取给药部位引流淋巴结,制备细胞悬液,进行两种改进方法的研究： (1) EdU代替BrdU,用流式细胞术代替ELISA进行淋巴结细胞增生测定,进行BrdU-ELISA改进研究. (2)测定致敏模型中多个免疫表型、细胞活化标志物和细胞因子变化.2.体外MUSST试验：使用U937细胞系,分别给予两种皮肤致敏剂、一种皮肤刺激剂,测定CD86的表达,同时IL-1β,IL-6,IL-12(P40),IL-12 (P70)的表达情况.[结果]1.EdU-FC结果：EdU注射后7小时,戊二醛高剂量组、HCA低剂量组、DNCB低、高剂量组的细胞增殖率均显著增加.2.致敏相关标志物检测：与溶媒组相比,戊二醛低剂量组、DNCB低、高剂量组的CD3E+细胞均有显著降低,CD45R+细胞均有显著增加,B/T细胞比值增加；DNCB低、高剂量组的CD86表达显著增加；HCA低、高剂量组、DNCB高剂量组的CD54表达增加,DNCB高剂量组的CD69表达增加；各模型组CD80表达未见明显改变；DNCB低、高剂量组CD4+CD 11A+CD25+、CD45R+CD40+、CD45R+CD86+表达显著升高,SLS组CD45R+CD86+表达也升高.3.HCA在CV75浓度和0.5倍CV75浓度、DNCB在0.5倍CV75浓度引起U937细胞CD86表达显著增加,SLS未引起CD86明显变化.[结论]EdU-FC方法可进行快速、有效的细胞增殖检测.CD45R、CD3E、B/T细胞比值、CD54对中等强度和强致敏剂均有较好的预测作用.CD86、CD69、CD4+CD 11A+CD25+、CD45R+CD40+仅对强致敏剂有较好预测作用.CD80、CD8+CD 11A+CD25+、CD3E+CD40+不是检测皮肤致敏的敏感指标.应用U937细胞进行体外MUSST试验评价化合物皮肤致敏性具有一定的准确性和特异性.