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目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的特征是睡眠中反复发生间歇性低氧血症和微觉醒,症状包括明显过度的白天嗜睡和认知缺陷。OSA有许多合并症,主要包括心血管疾病和2型糖尿病(T2DM)。认知功能障碍是T2DM的并发症之一,海马神经元凋亡是其主要病理机制。OSA合并T2DM对海马神经元和认知功能的影响尚不清楚。在中枢神经系统(CNS),低氧、高糖(HG)等物理刺激可诱导小胶质细胞活化,释放炎症介质。海马对低氧、HG、炎症等刺激最为敏感,可致海马神经元损伤,甚至凋亡,并最终引起认知缺陷的发生。然而小胶质细胞激活与海马神经元损伤之间的关系所涉及的相关机制尚未明确。高迁移率组蛋白B1(HMGB1)是一种非组蛋白DNA结合蛋白,可以从坏死细胞被动释放或从炎症细胞主动分泌至细胞外环境以引发炎症反应。作为一种损伤相关分子模式,细胞外HMGB1可能与小胶质细胞膜表面模式识别受体结合,如晚期糖基化终产物(RAGE)和Toll样受体(TLR)4等,导致促炎巨噬细胞或小胶质细胞表型,并介导各种细胞反应,包括细胞趋化运动和促炎细胞因子的释放(如TNF和IL-1)等。在间歇低氧(IH)合并HG(IH+HG)的刺激下HMGB1在神经炎症及神经元凋亡方面所扮演的角色尚未知晓。本研究以暴露于IH的T2DM动物模型KK-Ay小鼠和IH+HG处理的HT22海马神经元及BV2小胶质细胞为研究对象,以体内实验和体外实验两个方面互相验证,旨在探讨:1.IH暴露对T2DM小鼠认知功能的影响;2.IH暴露对T2DM小鼠海马神经元和小胶质细胞以及IH+HG暴露对HT22和BV2细胞的影响及相关机制;3.HMGB1在BV2和HT22细胞共培养时发挥的作用及相关机制。方法:1.构建OSA合并T2DM疾病重叠动物模型。以C57BL/6(C57)小鼠为健康对照(NC)组,IH暴露的C57小鼠为IH组,KK-Ay小鼠为T2DM组,IH暴露的KK-Ay小鼠为IH+T2DM组。暴露结束后,对各组小鼠进行Morris水迷宫测试,测量实验小鼠海马功能的神经生物学参数,评估空间学习和记忆功能。2.各组小鼠暴露结束后,取海马组织,检测神经炎症与凋亡。应用TUNEL染色观察各组小鼠海马冰冻切片中神经元凋亡情况,同时采用DUFH-DA法检测海马组织中活性氧(ROS)水平;应用免疫荧光分析海马冰冻切片中小胶质细胞表型变化;通过western blot法定量分析海马组织中cleaved-caspase-3,p-Akt,p-GSK-3β,activeβ-catenin等凋亡相关蛋白以及iNOS,CD206,NF-κB-p65,TNF-α,IL-1β等炎症相关蛋白表达情况。对BV2及HT22细胞分别进行体外单独培养和transwell共培养。将BV2细胞分为NC组,HG组和IH+HG组,采用免疫荧光分析BV2细胞表型变化;检测各组BV2细胞内ROS水平;通过western blot法定量分析各组BV2细胞中iNOS,CD206,NF-κB-p65,TNF-α,IL-1β等炎症相关蛋白表达情况。将HT22细胞分为NC组,HG组和IH+HG组,以及Co-culture-NC组,Co-culture-HG组和Co-culture-IH+HG组,检测各组HT22细胞内ROS水平;通过western blot法定量分析各组HT22细胞中cleaved-caspase-3,p-Akt,p-GSK-3β,activeβ-catenin等凋亡相关蛋白表达情况。3.将BV2细胞分为NC组,HG组和IH+HG组,应用实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)检测各组BV2细胞中HMGB1 mRNA的表达;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组BV2细胞培养基中HMGB1蛋白分泌情况;通过western blot法定量分析各组BV2细胞中加入HMGB1 siRNA后HMGB1蛋白表达水平。将HT22细胞分为NC组,IH+HG组,Co-culture(IH+HG)组,Co-culture(IH+HG)+HMGB1 siRNA组,应用TUNEL染色观察各组HT22细胞凋亡情况;通过western blot法定量分析HMGB1siRNA转染后共培养的HT22细胞中cleaved-caspase-3及BV2细胞中NF-κB-p65的蛋白表达情况。结果:一、IH暴露对T2DM小鼠认知功能的影响:1.在Morris水迷宫测试中,四个实验组在游泳速度上没有差异(P>0.05)。2.T2DM组和IH组之间的逃避潜伏期没有差异(P>0.05),但均高于NC组(P<0.05)。IH+T2DM组比T2DM组具有更长的逃避潜伏期(P<0.05)。3.T2DM组和IH组之间的平台穿越次数和在第四象限中花费的时间百分比没有差异(P>0.05),但均低于NC组(P<0.05);IH+T2DM组比T2DM组的平台穿越次数和第四象限花费的时间百分比更少(P<0.05)。二、IH+HG暴露对小鼠海马神经元和小胶质细胞及其细胞系的影响及其相关机制。1.在海马组织中观察到的TUNEL阳性细胞数目在T2DM组和IH组之间差异无统计学意义(P>0.05),但均较NC组明显增多(P<0.05),而IH+T2DM组比T2DM组进一步增多(P<0.05)。与NC组相比,T2DM组和IH组海马组织中cleaved-caspase-3的蛋白水平增加(P<0.05)同时p-Akt,p-GSK-3β和activeβ-catenin的蛋白表达较NC组减少(P<0.05),T2DM组和IH组之间差异无统计学意义(P>0.05),IH+T2DM组比T2DM组海马组织中cleaved-caspase-3蛋白表达进一步增加(P<0.05)同时p-Akt,p-GSK-3β,activeβ-catenin蛋白表达进一步减少(P<0.05)。在T2DM组和IH组海马组织中M1型标志物表达较NC组增多(P<0.05),M2型标志物表达较NC组减少(P<0.05),T2DM组和IH组之间差异无统计学意义(P>0.05);IH+T2DM组比T2DM组M1型标志物表达进一步增多(P<0.05),M2型标志物表达进一步减少(P<0.05)。同时在T2DM组和IH组海马组织中ROS阳性细胞数和NF-κB-p65,TNF-α,IL-1β炎症相关蛋白表达较NC组增多(P<0.05),T2DM组和IH组之间差异无统计学意义(P>0.05),IH+T2DM组比T2DM组进一步增多(P<0.05)。2.与NC组相比,BV2细胞形态在HG组中发生剧烈变化,呈现变形虫形态且分支减少,而IH+HG组比HG组以上变化更明显。在HG组中M1型标志物表达均较NC组增多(P<0.05),M2型标志物表达较NC组减少(P<0.05),IH+HG组中M1型标志物表达较HG组进一步增多(P<0.05),M2型标志物表达较HG组进一步减少(P<0.05);HG组BV2细胞中ROS阳性细胞数目和NF-κB-p65,TNF-α,IL-1β炎症相关蛋白表达较NC组增多(P<0.05);IH+HG组BV2细胞中ROS阳性细胞数目和NF-κB-p65,TNF-α,IL-1β炎症相关蛋白表达较HG组进一步增多(P<0.05)。与NC组相比,HG组HT22细胞中ROS的产生增加(P<0.05),IH+HG组比HG组HT22细胞中的ROS产生的更多(P<0.05),而Co-culture(IH+HG)组比IH+HG组HT22细胞中ROS表达进一步增多(P<0.05)。与NC组相比,HG组HT22细胞中cleaved-caspase-3蛋白表达增多(P<0.05)同时p-Akt,p-GSK-3β,activeβ-catenin蛋白表达均减少(P<0.05),IH+HG组比HG组HT22细胞中cleaved-caspase-3蛋白表达更多(P<0.05)同时p-Akt,p-GSK-3β,activeβ-catenin蛋白表达更少(P<0.05),而Co-culture(IH+HG)组比IH+HG组HT22细胞中cleaved-caspase-3蛋白表达进一步增多(P<0.05)同时p-Akt,p-GSK-3β,activeβ-catenin蛋白表达进一步减少(P<0.05)。三、HMGB1 siRNA对共培养transwell系统中接受IH+HG暴露的BV2-HT22细胞的作用及相关机制。1.与NC组相比,HG组中的BV2细胞内外HMGB1蛋白表达均增加(P<0.05),而IH+HG组比HG组BV2细胞内外HMGB1蛋白表达更多(P<0.05)。2.与NC组相比,IH+HG组HT22细胞中的TUNEL阳性细胞数目增多(P<0.05),Co-culture(IH+HG)组比IH+HG组HT22细胞中TUNEL阳性细胞的数目更多(P<0.05),Co-culture(IH+HG)+HMGB1siRNA组比Co-culture(IH+HG)组HT22细胞中的TUNEL阳性细胞数目减少(P<0.05)且与NC组之间没有明显差异(P>0.05)。与NC组相比,IH+HG组BV2细胞中NF-κB-p65蛋白表达水平和HT22中cleaved-caspase-3蛋白表达水平均增加(P<0.05),Co-culture(IH+HG)组比IH+HG组BV2细胞中NF-κB-p65蛋白表达和HT22中cleaved-caspase-3蛋白表达增加更多(P<0.05),Co-culture(IH+HG)+HMGB1siRNA组比Co-culture(IH+HG)组BV2细胞中NF-κB-p65蛋白表达和HT22中cleaved-caspase-3蛋白表达减少(P<0.05)且与NC组之间没有明显差异(P>0.05)。结论:1.IH暴露加重T2DM模型小鼠的认知缺陷。2.IH暴露促进T2DM小鼠海马中小胶质细胞的活化、氧化应激和炎症反应,并通过抑制PI3K/Akt/GSK3β信号通路加重海马神经元凋亡的发生;同时IH+HG暴露促进BV2细胞的活化、氧化应激和炎症反应,并通过抑制PI3K/Akt/GSK3β信号通路加重HT22细胞凋亡的发生。3.HMGB1 siRNA可以抑制HMGB1的产生,打断激活的BV2细胞对HT22细胞的二次打击,从而减轻HT22细胞凋亡的发生。