【摘 要】
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研究目的:基因突变导致的细胞过度增殖以及凋亡抑制与肿瘤的发生密切相关.我们前期研究显示Notch1 基因在中国人群头颈鳞癌(HNSCC)中的突变率高达40%,部分胞外段的热点突变(如V1754L)与口腔鳞癌(OSCC)的转移及不良预后相关.本次实验旨在探究膜系留Notch1(V1754L)在口腔癌前病变及口腔鳞癌中的作用. 研究方法:本次实验我们对78 个诊断为口腔白斑(OL)的病理标本及正常粘膜
【机 构】
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南京医科大学附属口腔医院/江苏省口腔医院口腔颌面外科
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研究目的:基因突变导致的细胞过度增殖以及凋亡抑制与肿瘤的发生密切相关.我们前期研究显示Notch1 基因在中国人群头颈鳞癌(HNSCC)中的突变率高达40%,部分胞外段的热点突变(如V1754L)与口腔鳞癌(OSCC)的转移及不良预后相关.本次实验旨在探究膜系留Notch1(V1754L)在口腔癌前病变及口腔鳞癌中的作用. 研究方法:本次实验我们对78 个诊断为口腔白斑(OL)的病理标本及正常粘膜组织标本利用免疫组织化学(IHC)方法进行Notch1 蛋白染色分析,探究正常粘膜、白斑及相对应的转变为口腔鳞癌的粘膜组织中膜系留Notch1的表达变化,通过统计膜系留Notch1在口腔鳞癌标本中的表达探究膜系留Notch1与临床病理分级的关系,通过生存曲线分析膜系留Notch1与口腔鳞癌预后的关系.此外,我们构建了膜系留 Notch1的基因表达载体pcDNA3-Notch1V1754L和野生型Notch1载体pcDNA3-Notch1WT,转染到人口腔鳞癌细胞系SCC9、CAL27 中.通过免疫荧光染色方法检测SCC9/CAL27-Notch1V1754L(实验组)和SCC9/CAL27-Notch1WT(对照组)细胞中Notch1 蛋白的亚细胞定位;通过Western blot、RT-qPCR 方法检测两组细胞的Notch1 经典信号通路的激活情况;同时,利用CCK-8 实验、Transwell 侵袭实验、细胞划痕等实验,检测细胞的增殖、侵袭和迁移能力的变化;通过Western blot 检测细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白的表达变化;检测EGFR信号通路相关分子的表达变化. 研究结果:本次实验发现在19 个转变为口腔鳞癌的白斑标本中膜系留Notch1的表达明显增加(p=0.002),且与不良预后有关(p=0.001).免疫荧光结果显示,相比于pcDNA3-Notch1 WT,转染了pcDNA3-Notch1 V1754L 后,Notch1 蛋白表达集中于细胞膜上;Western blot 及RT-qPCR结果显示,Notch1 活化型NICD 蛋白表达量明显下降,表明V1754L 突变使Notch1 经典信号通路失活;CCK-8 实验等细胞周期检测结果表明,Notch1V1754L 突变促进了细胞周期的循环,增强了细胞的增殖水平;Transwell 侵袭实验、细胞划痕实验表明,实验组细胞的侵袭性、迁移能力增强;凋亡相关蛋白、流式细胞仪的细胞凋亡检测表明:V1754L 突变增强了细胞的周期变化,且EGFR 通路广泛激活. 研究结论:Notch1 基因V1754L 突变产生了膜系留Notch1,导致Notch1 经典信号通路失活,并使OSCC 细胞的增殖能力增强,侵袭性、迁移能力增强,并与EGFR 通路激活相关.
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