【摘 要】
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目的构建细胞穿膜肽PEP-1与vMIP-Ⅱ融合基因的表达质粒,原核表达、纯化并鉴定PEP1-vMIPⅡ融合蛋白,鉴定该蛋白的穿膜功能,研究其对血管增生相关基因表达的影响。方法将化学合
【机 构】
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杭州师范大学医药卫生管理学院; 杭州市第三人民医院; 石河子大学新疆地方病与民族高发病省部共建教育部重点实验室;
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目的构建细胞穿膜肽PEP-1与vMIP-Ⅱ融合基因的表达质粒,原核表达、纯化并鉴定PEP1-vMIPⅡ融合蛋白,鉴定该蛋白的穿膜功能,研究其对血管增生相关基因表达的影响。方法将化学合成的细胞穿膜肽PEP1和vMIP-Ⅱ基因克隆到原核表达载体pET15b,构建pET15b-pep-1-vmip-Ⅱ质粒。表达纯化后,Western-blot鉴定蛋白,荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白的穿膜功能。real time PCR检测该蛋白作用对HMEC-1细胞内血管增生相关基因表达的改变。结果 DNA测序和酶切结果鉴定了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体构建正确,Westem blot鉴定纯化的融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ与所预测分子量相符。激光共聚焦显微镜检测到该蛋白能够进入细胞,在HMEC-1细胞内上调了促血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。结论成功构建了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体,表达纯化的PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白具有穿透细胞膜的功能,且能显著上调促进血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。
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