论文部分内容阅读
目的:研究Ⅱ型登革病毒（DENV-2）感染原代人肝窦内皮细胞（HHSEC）后,HHSECs的凋亡、自噬情况,以及ICAM-1和Beclin-1 mRNA水平的表达,并分析它们在登革病毒致病过程中可能的机制。方法:流式细胞术检测细胞膜表面CD31分子;免疫组化法检测细胞浆Ⅷ因子的表达,以鉴定HHSECs。RT-PCR扩增DENV-2 NS1基因部分序列,鉴定病毒;根据NS1的序列设计酶切位点,HindⅢ酶切,预期酶切片段大小为228bp和185bp;以105TCID50的DENV-2作用于HHSECs,实时荧光定量PCR动态检测DENV-2 NS1部分序列;CCK8法动态观察受感染细胞的损伤情况并计算其抑制率。实时荧光定量PCR动态检测被DENV-2感染的HHSECs的ICAM-1及Beclin-1（自噬相关基因）mRNA水平的表达。流式细胞术检测被DENV-2感染后的HHSECs细胞凋亡率,LC3B（自噬相关蛋白）以及ICAM-1的表达。结果:细胞"鹅卵石"样排列;免疫组化法检测HHSECsⅧ因子的表达,细胞浆含棕黄色的颗粒;流式细胞仪检测CD31表达率87.1%,符合HHSECs的特点。RT-PCR扩增DENV-2 NS1基因部分序列,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,长度在400bp左右,HindⅢ酶切得到长度约200bp;D与预期长度;ENV-2对C6/36细胞的TCID50为10-6.845/ml。Real time PCR检测HHSECs中NS1基因mRNA的表达且于36h达峰值,以12h为对照,计算2-△△Ct值为11.33±1.77（P<0.05）。病毒作用细胞后,CCK8法检测DENV-2对细胞的毒性作用,细胞与未感染组有差别。流式细胞术动态检测被DENV-2感染的HHSECs表面有ICAM-1表达。Real time PCR检测HHSECs中相关基因mRNA的表达水平Beclin1及ICAM-1 mRNA在24h达峰值,以未感染组为对照,2-△△Ct值分别为46.77±2.55和40.97±4.91。结论:且DENV-2对HHSECs生长有抑制作用;诱导ICAM-1上调,激活HHSECs。感染后,LC3B及Beclin1的表达增高;DENV-2感染早期可诱导HHSEC的细胞凋亡、自噬。提示细胞自噬和凋亡参与DENV感染过程。