论文部分内容阅读
目的:本实验通过研究表达活化性KIR2DS1基因的NK细胞对DC的杀伤作用及分析体外KIR2DS1阳性的NK细胞与HLA-C2+DC相互作用后CCR7的表达,探究异源反应性NK细胞预防GVHD的机制。方法:1.KIR及HLA-Cw基因检测:采用聚合酶链式反应和序列特异性引物(PCRSSP)基因分型技术检测20例健康供者的KIR基因;采用聚合酶链式反应-直接测序分型法(PCRSBT)检测20例健康供者和10例AML患者的HLA-Cw基因。2.NK细胞的分选及扩增培养:抽取符合实验要求的健康志愿者外周血,通过RosetteSep富集人NK细胞负选试剂盒分选NK细胞,采用流式细胞仪检测分选前后NK细胞的纯度。分选后的NK细胞体外扩增培养,培养14天。3.DC的体外培养及鉴定:抽取符合实验要求的初诊AML患者外周血,提取单个核细胞,于37℃、5%C02饱和湿度培养箱中孵育2h,收集贴壁细胞用于诱导培养DC。采用倒置光学显微镜观察DC形态变化及流式细胞仪于培养第5、7天检测DC免疫表型。4.CCR7阳性表达率的检测:采用流式细胞仪检测CCR7的表达。5.细胞杀伤活性的检测:采用CCK-8比色法检测效靶细胞比5:1、10:1、20:1条件下,NK细胞对DC的杀伤活性。结果:1.流式细胞仪检测分选后的NK细胞,其纯度明显增加。2.NK细胞培养14天后,实验组与对照组相比,扩增倍数增高。3.DC培养第7天,大部分细胞开始悬浮不贴壁,倒置光学显微镜下观察细胞周围可见大量长而粗的树枝样突起,为典型DC形态。随着培养时间的增加,DC表面共刺激分子CD80、CD86、HLA-DR表达增高,特异性分子标志物CD1a表达下降,而成熟分子标志物CD83表达显著增高。4.NK细胞与HLA-C2+DC共培养后,KIR2DS1+NK细胞组CCR7阳性表达率明显增高(P<0.05)。5.同一效靶比(10:1)下,KIR2DSl+NK细胞对DC杀伤作用高于KIR2DS1-的NK细胞(P<0.05);在效靶比10:1的情况下,KIR2DSl+NK细胞经单抗封闭KIR2DS1后,对DC的杀伤活性明显下降,封闭前后相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。同一效靶比(10:1)下,C1/C1组KIR2DSl+NK细胞对C2/C2组DC的杀伤活性高于C1/C1组和C1/C2组。结论:活化性KIR2DS1基因能有效介导同种异体NK细胞杀伤DC,降低GVHD的发生;同时与DC共培养后CCR7表达率增加,推断其与NK细胞获得趋化性能相关。从而为临床选择合适的供者提供依据。