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【目的】对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是临床广泛应用的解热镇痛类非处方药,其过量应用会诱导药物性肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)。目前,临床上对APAP诱导肝损伤的解毒仅限于使用N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)。本实验主要研究天然酚酸类化合物咖啡酸(Caffeic acid,CA)对APAP诱导肝毒性的拮抗作用及其机制。【方法】在体内实验中,小鼠连续6天灌胃给药CA(10mg/kg,30mg/kg),末次给完CA 1 h后给予APAP(400 mg/kg),给予APAP 4 h后处死取材。利用试剂盒来检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)/天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)活力和肝组织的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量变化。通过HE染色(hematoxylin-eosin staining)来分析肝组织的损伤程度。在体外实验中,采用MTT、Western-Blot、报告基因分析等方法检测CA对细胞存活率的影响;对NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)的转核的影响;对Nrf2的下游血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)和醌氧化还原酶(NAD(P)H dehydrogenase,quinone1,NQO1)蛋白表达的影响。采用荧光底物检测CA对CYP2E1,CYP3A4,CYP1A2酶活性的影响。【结果】在体内实验中,给予APAP(400mg/kg)后,ALT/AST显著上升(p<0.01,p<0.01),而CA(30 mg/kg)能显著降低APAP所升高的ALT/AST(p<0.01,p<0.05)。APAP能显著增加肝组织的ROS含量(p<0.001),CA(10 mg/kg,30mg/kg)能减少APAP升高的ROS含量(p<0.01,p<0.05),APAP能显著降低肝内GSH含量(P<0.001),CA(10mg/kg,30 mg/kg)能逆转APAP所引起的GSH含量的降低(p<0.05,p<0.05)。病理切片结果显示,APAP组肝细胞可见大范围出血,细胞边界模糊,玻璃样病变或脂肪样病变和明显的肝细胞坏死,预防给药CA(10mg/kg,30mg/kg)两组的肝细胞损伤有显著改善,出血和肝细胞坏死减少,肝细胞排列有序。在体外实验中,与APAP组相比,CA(25μM,50μM)能显著提高细胞存活率(p<0.05,p<0.001)和降低细胞内ROS含量(p<0.01,p<0.01)。Western-Blot结果显示,CA(50μM)在36 h能显著增加Nrf2的转核(p<0.01),继而增加Nrf2下游HO-1和NQO1蛋白表达(p<0.05,p<0.05),同时HO-1、NQO1的抑制剂ZnPP、Dim能显著降低CA对APAP肝毒性的保护作用。细胞存活率分析实验结果表明当运用Nrf2 siRNA后,CA抑制APAP肝毒性的作用明显减弱。进一步实验表明CA可以降低Nrf2抑制剂Keap1(kelch-like ECH-associated protein-1)蛋白的表达,同时分子对接实验表明CA可以与Keap1上Nrf2蛋白结合位点相互作用,从而抑制了Keap1与Nrf2结合,导致Nrf2转录激活。最后体外酶活性实验分析实验表明CA对CYP2E1,CYP3A4酶活性只有微弱的抑制作用,并且CA对APAP毒性代谢产物NAPQI(N-acetyl-p-benzoquinone imine)所诱导的肝细胞毒性有明显的抑制作用。【结论】本实验的结果表明,CA通过与Keap1上Nrf2结合位点相互作用,阻断了Keap1与Nrf2的结合,诱导Nrf2转录入核,增加了其下游抗氧化基因HO-1,NQO1的表达,抵御APAP诱导的肝毒性,同时CA还可以降低Keap1的表达,进一步促进Nrf2的激活。