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TGF-β超家族成员BMP15在促进卵泡发育和阻止黄体早熟过程中发挥重要作用,直接影响到动物排卵数和窝产仔数.自然基因型BMP15-／_的母羊排卵数和产子数显著多于BMP15-／+型,而BMP15-／-的母羊是不育的,因此结合锌指核酸酶对水牛BMP15基因进行杂合突变有望提高水牛的繁殖力.为探讨对水牛BMP15进行定点突变的可行性,参考发布的奶牛BMP15全基因序列,设计特异性扩增引物经RT-PCR和常规PCR分别扩增获得长为1185bp的水牛BMP15全长CDS和6.49 Kb的全基因序列.以获得的水牛BMP15全长CDS的为模板，通过在线软件ZiFiT软件和zincfinger tool筛选出一组高效的ZFN结合靶位点，设计并构建4对ZFN真核表达载体:pcDNA3.1(-)-ZFN1, pcDNA3.1(-)-ZFN2, pcDNA3.1(-)-ZFN3和pcDNA3.1(-)-ZFN4。同时，以水牛BMP15全基因序列为模板，设计引物，经PCR扩增获得长度分别为4.5Kb和1.5Kb的同源臂，构建得到五个不同的打靶载体质粒:p4.5K-CMV-EGFP-sv40pA-SV40-neo-hsvTKpA, p4.5K-SV40-neo-hsvTKpA、 p4.5K-PGK-neo-Rabbit B-globinpA、 p4.5K-PGK-neo和p 1.5K-CMV-EGFP-sv40pA-SV40-neo-hsvTKpA，经PCR和双酶切证实与预期的结果相符。目前正在转染水牛胎儿成纤维细胞并进行筛选，探讨锌指酶基因打靶的效率。