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琼胶酶是一类能够降解琼胶,生成琼胶寡糖的糖苷水解酶.它降解琼胶产生的琼胶寡糖,具有多种生理活性,在食品、药物、化妆品等领域具有广泛的应用前景.
本课题从实验室保藏的海洋来源菌株中筛选到产琼胶酶菌株BY、BN,并结合形态学鉴定和16S rRNA分析,确定菌株BY为弧菌(Vibrio sp.),菌株BN为产微球茎菌(Microbulbifer sp.).菌株BY、BN产琼胶酶活性分析表明:菌株BY的产酶最适温度和pH分别为50℃和6.0;菌株BN产琼胶酶的最适温度为40℃,最适pH为6.0.
利用Touch down PCR与染色体步移技术相结合的方法，从菌株BY的基因组中克隆得到新的琼胶酶基因Vibrio sp.BY，该基因全长2232bp，编码744个氨基酸，理论分子量为85.4kD，构建重组表达载体pET22a-Vibrio sp.BY，并成功在E.coli BL21(DE3)诱导表达，DNS法测得重组琼胶酶活力为71.73 U/mL。酶学性质研究表明该重组琼胶酶最适反应温度和pH分别为50℃和7.0，在温度30-50℃及pH5.0-7.0条件下较稳定。Na+、K+、Mg2+、Ca2+等金属离子对重组琼胶酶具有促进作用，Zn2+、Fe2+、Mn2+、SDS、EDTA等对重组琼胶酶具有抑制作用。
PCR扩增获得菌株BN的琼胶酶基因N3，该基因全长924bp，编码308个氨基酸，理论分子量为34.3 kD。构建重组表达载体pET28a-N3，并在E.coli BL21(DE3)中实现了异源表达，DNS法测得重组琼胶酶活力为228.3U/mL，是原始菌株BN琼胶酶活力的3.04倍。对重组琼胶酶的诱导条件进行优化，优化后的诱导条件为:超声波破碎时间15min、诱导时间16h、诱导温度30℃,IPTG终浓度1mM，是优化前的1.35倍。通过镍离子亲和层析，对重组琼胶酶进行分离纯化，得到电泳纯的重组蛋白，比酶活为700.59 U/mg。该重组琼胶酶的酶学性质研究表明，最适温度及最适pH分别为50℃,pH6.0，具有较好的热稳定性和pH稳定性。Na+,K+,Mg2+金属离子对重组琼胶酶具有促进作用，Ca2+，Zn2+,Fe2+,Mn2+,SDS,EDTA等对重组琼胶酶具有抑制作用。动力学方程研究表明，重组酶的Vm值为10.82umoL/min/mL，Km值为13.41mg/mL。该重组琼胶酶的降解产物以二糖和四糖为主。