目的利用焦磷酸测序技术,建立一种高通量、快速、准确的结核分枝杆菌利福平耐药性基因检测新方法。方法应用生物素标记的引物扩增含利福平耐药突变区的 rpoB 基因片段,用链亲和素包被的磁珠分离,制备焦磷酸测序的单链 DNA 模板。设计2个测序引物,在 PSQ96A 焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序。测序所得序列与 H₃₇ R_v 标准菌株 rpoB 基因序列进行比对,确定结核分枝杆菌临床分离株 rpoB 基因的突变类型和突变位置。所测样品部分进行直接测序验证结果。结果 54株临床分离株的焦磷酸测序结果显示,除1株因单链制备原因未得到检测结果外,其余临床株及 H₃₇Rv 标准株均得到准确检测结果。其中21株利福平敏感株均未检测到 rpoB 基因核心区突变,32 株利福平耐药株中都检测到突变,共8种不同类型突变,其中1株为511和516位点联合突变,最常见的突变位点是531位和526位,其突变率分别为 68．8%（22/32）和18．8%（6/32）。结论焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是近年来新出现的一种依靠生物发光进行的实时 DNA 测序技术。与传统的双脱氧核苷酸链终止法（Sanger 法）相比, 该技术无需进行电泳,操作简单,通量高,速度快,能在1h 内完成96份样品的精确测序,用于基因突变分析时,是除 Sanger DNA 测序法外唯一能提供序列信息的技术。结核分枝杆菌耐药的分子机理复杂,所涉及的耐药相关基因和基因突变位点也繁多杂乱,并且处于不断变异增加中。焦磷酸测序技术具备同时对大量样品进行测序分析的能力,通量高,灵活性大,可对结核杆菌多个耐药基因或同一耐药基因多个突变位点同时进行检测。因此,建立以焦磷酸测序技术为基础的结核分枝杆菌耐药基因快速检测平台,可满足临床批量检测的需求,对临床医生及时调整治疗方案、减少耐药株的产生、减少疾病的再传播有重要意义。