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目的:深入研究联合应用BMP-2、VEGF和TGF-β壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统体外诱导成骨的时效关系,以及诱导成骨的效率、质量和网络调控机制。方法:采用离子交联法制备负载BMP-2、VEGF或TGF-β的壳聚糖纳米缓释微球,利用壳聚糖制作温敏性微孔水凝胶,将负载生长因子的纳米缓释微球包裹入水凝胶内,制备出负载BMP-2、VEGF和TGF-β壳聚糖纳米微球水凝胶双重缓释系统。体外培养小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1),第一阶段实验以成骨诱导培养基(oeteogenic medium,OM)中添加BMP-2、VEGF和TGF-β的不同组合方式设计实验分组,以单纯OM培养基为对照组;第二阶段实验以OM培养基中添加不同组合的负载BMP-2、VEGF和TGF-β的壳聚糖纳米缓释系统设计实验分组,以单纯O M培养基为对照组。使用电镜、粒度仪及Elisa试剂盒等分析纳米微球粒径,形态,载药率和释放曲线等。采用CCK-8实验检测细胞的体外增殖能力,成骨效果检测采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及其活性定量检测、茜素红染色和矿化沉积定量分析4种方法。采用RT-PCR检测成骨相关基因RUNX2、ALP和OCN的表达情况,Western blot检测成骨诱导相关信号通路的表达。结果:负载外源性生长因子的壳聚糖纳米微球平均粒径约(197±7.1)nm,分散指数PDI=0.21,载药率为(59.84±3.06)%,成球性好、分散较均匀并且可以高效载药。壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统前48h累积释药率达(34.78±3.42)%,第30天累积释药率达(78.05±3.22)%,具有良好的缓释效果和缓释效率。第一阶段实验显示,诱导3天后,联合应用BMP-2、VEGF和TGF-β时ALP染色及其活性定量检测均高于其余实验组和对照组(P<0.05)。诱导第7天和14天后,联合应用BMP-2和VEGF组的ALP染色及其活性定量检测、茜素红染色和矿化沉积定量分析均高于联合应用BMP-2、VEGF和TGF-β组及其余组。依据时效关系改进联合应用方式后,前期联合应用BMP-2、VEGF和TGF-β,而后期联合应用BMP-2和VEGF时,诱导第7天和第14天时,ALP染色及其活性定量检测、茜素红染色和矿化沉积定量分析均高于联合应用BMP-2和VEGF组(P<0.05)。同时时效关系改进后RUNX2的表达量也较其余实验组显著提高(P<0.05)。第二阶段实验ALP染色及其活性定量检测、茜素红染色和矿化沉积定量分析检测结果显示,联合应用负载BMP-2和VEGF的壳聚糖纳米微球水凝胶双重缓释系统和负载TGF-β1的壳聚糖纳米微球单重缓释系统时,诱导成骨的效果和质量明显优于其余实验组(P<0.05),同时RUNX2、ALP和OCN基因表达量也表现出相同的结果(P<0.05)。两个阶段Western blot显示,依据时效关系优化联合应用BMP-2、VEGF和TGF-β和联合应用负载BMP-2、VEGF或TGF-β的壳聚糖纳米缓释系统均主要通过经典的smad信号转导通路来促进成骨分化,MAPK下游通路p38和erk1/2信号通路的磷酸化辅助调节成骨分化能力。结论:依据时效关系联合应用负载BMP-2和VEGF的壳聚糖纳米微球水凝胶双重缓释系统和负载TGF-β的壳聚糖纳米微球单重缓释系统时,能够显著提高诱导成骨的效率、质量,这一调控过程主要通过经典的smad信号转导通路来实现,MAPK下游通路p38和erk1/2信号通路可能发挥辅助调节作用。