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目的 肝癌干细胞是一群具有体外自我更新、侵袭转移及放化疗抵抗等“干性”生物学特征的肿瘤细胞.新近研究发现CD44 是常见的肝癌干细胞的表面标记物,其中CD44v6 被证实与许多肿瘤的侵袭转移密切相关.众所周知,肿瘤干细胞“干性”的维持依赖于信号通路的调控,而一些研究表明c-Met 信号通路可能参与肿瘤干细胞“干性”的维持.且发现c-met/p-met 基因在肝癌组织中表达高于癌旁组织,因此,本研究旨在探讨c-met 信号通路在CD44v6+肝癌干细胞“干性”维持中的作用和机制.方法 (1)采用流式细胞术测定各细胞系表面CD44s、CD44v6、CD44v7-8、CD44 分子的表达情况.(2)对分选出的CD44v6+/CD44v6-细胞进行浮球实验等一系列“干性”鉴定实验,以确定肝癌干细胞合适的表面标记物.(3)用western blotting 检测CD44v6+/-细胞之间c-met/p-met、干性基因nanog 表达差异;(4)将分选得到的CD44v6+细胞分为两组,一组为空白组,另一组下调c-met 基因,用Western Blotting 检测下游erk,p-erk,c-jun,和干性基因nanog 的变化及肝癌侵袭转移能力的变化,在下调c-met 基因后上调c-jun 基因的表达,观察Nanog 表达恢复情况;(5)下调干性基因nanog 表达,观察上游c-met,p-met,erk,p-erk,c-jun 有无变化;(6)采用免疫组织化学方法分别检测15 对人肝癌组织中癌和癌旁组织中CD44v6 与其它指标的关系.结果 (1)浮球培养实验:显示分选出的CD44v6+较CD44v6-细胞具有更强的自我更新能力(p<0.05);平板克隆实验:CD44v6+与CD44v6-细胞相比克隆形成能力更高(p<0.05);Transwell 迁移和侵袭实验:CD44v6+细胞在迁移和侵袭方面的能力较CD44v6-细胞更强(p<0.01,p<0.05);体外成瘤实验:CD44v6+细胞的成瘤能力明显强于CD44v6-细胞(p<0.05);化疗药物抵抗实验:分选出的CD44v6+较CD44v6-细胞有更强的抵抗化疗药物的能力(p<0.05).NOD/SCID 小鼠体内侵袭转移模型结果 :CD44v6+细胞组中在小鼠的肝脏部位形成了远处转移灶,而CD44v6-细胞组中没有远处转移灶的形成.(2)Western Blotting 检测CD44v6+干细胞中c-met,p-met 和干性基因nanog 的表达明显高于CD44v6-细胞(p<0.05),(3)Transwell 侵袭和迁移实验显示抑制c-Met 信号通路后CD44v6+肝癌干细胞的侵袭和迁移能力均下降.Western blotting 显示下游erk,p-erk,c-jun 和干性基因nanog表达下降;c-jun 上调后,Nanog 表达恢复;抑制nanog 基因后,上游基因表达无明显影响;(4)临床组织标本中CD44v6 的表达与p-met 的表达明显相关(p<0.05).结论 c-met 信号通路在CD44v6+细胞中的活化程度明显高于CD44v6-细胞组,并且抑制CD44v6+肝癌干细胞c-met 信号通路后,CD44v6+肝癌干细胞的“干性”特征丧失、相关干性基因的表达下调,并且p-met/p-erk/c-jun/nanog 信号通路可能参与CD44v6+肝癌干细胞“干性”特征的维持.在肝癌临床组织标本中进一步验证了CD44v6 与c-met 信号通路的激活存在相关性.