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引言口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起一种急性、热性、高度接触性传染病,其易感动物包括牛、羊、猪等家畜及野生偶蹄动物。FMDV是单股、正链RNA病毒,属于微RNA病毒科、口蹄疫病毒属的成员。FMDV可分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型共7种血清型,不同血清型毒株间不产生交叉免疫保护;每个血清型都包含众多基因型,血清型和基因型内各分离株存在广泛的抗原变异。在发展中国家使用疫苗预防口蹄疫,快速准确地诊断也是有效控制口蹄疫的关键。本研究制备FMDV各血清型毒株共享的单抗并鉴定其针对的表位,目的是研发FMDV血清型广谱性病原诊断和抗体检测试剂。材料与方法用提纯并灭活的A型FMDV病毒抗原免疫BALB/c小鼠,经融合、间接ELISA筛选和间接免疫荧光（IFA）验证,获得1株稳定分泌多血清型FMDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D9。进而,用试剂盒鉴定Ig亚类;间接ELISA和中和试验检测抗体效价;硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数;经IFA和Western blot鉴定,确定单抗3D9所识别的表位为线性或构象表位。结果与讨论本研究采用纯化的A型FMDV病毒抗原免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA筛选和间接免疫荧光（IFA）验证,获得了1株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3D9,为IgG1/κ亚类。经间接ELISA检测显示,3D9杂交瘤细胞培养上清的抗体效价分别为1:6400,小鼠腹水效价为1:105;硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为2.5mol/L;经IFA鉴定,单抗3D9为A型、O型和Asia1型共享单抗。经Western blot分析表明:3D9单抗所识别表位均为构象表位。3D9单克隆抗体的获得,为口蹄疫病毒和诊断技术研究提供了重要的实验材料。3D9是一株识别A型、O型和Asia1型FMDV共享型构象表位的单抗,为IgG1/κ亚类。为确定FMDV 3D9识别表位的性质,本研究用噬菌体随机十二肽库对单抗3D9进行3轮生物淘选,经噬菌体ELISA和抗原竞争抑制试验鉴定,获得12个与单抗3D9均发生特异性反应的阳性噬菌体克隆;序列测定及比对分析显示,有4个噬菌体克隆展示一个共有基序GVYxxAYxW（x代表任意氨基酸）,初步认定其为单抗3D9识别的模拟表位;通过与FMDV 7个血清型不同毒株的氨基酸序列进行比对发现,该3D9模拟表位与VP2蛋白序列89GVYxxxxxxxAYxxxxW105高度同源,而且该真实序列在各血清型FMDV毒株之间是高度保守的,表明3D9表位是FMDVVP2蛋白的一个高度保守性表位;为进一步验证3D9表位的存在,利用反向遗传技术成功拯救了表位突变株V90A,经双抗体夹心ELISA检测表明,V90氨基酸残基对3D9表位的活性起重要作用。总之,本研究在制备口蹄疫病毒单抗的基础上对其识别的表位进行鉴定,单抗3D9识别的表位是位于VP2蛋白上的7个血清型FMDV共享的构象表位。这些研究将为口蹄疫病毒诊断和抗体检测试剂的开发提供理论依据和实验基础。