【摘 要】
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目的 运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞(16HBE)中的表达,为后续研究NF-κBp65在环境化学污染物诱导细胞DNA损伤修复中的作用提供实验模型.方法 根据NF-κBp65的mRNA序列,结合文献,利用Ambion网上设计软件设计4条针对该基因不同靶点的siRNA干扰序列,通过T7体外转录系统转染入16HBE细胞,荧光定量PCR检测NFκBp65mRNA.
【机 构】
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南方医科大学公共卫生与热带医学学院,广东 广州 510515; 中山大学公共卫生学院,广东 广州
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目的 运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞(16HBE)中的表达,为后续研究NF-κBp65在环境化学污染物诱导细胞DNA损伤修复中的作用提供实验模型.方法 根据NF-κBp65的mRNA序列,结合文献,利用Ambion网上设计软件设计4条针对该基因不同靶点的siRNA干扰序列,通过T7体外转录系统转染入16HBE细胞,荧光定量PCR检测NFκBp65mRNA.选择抑制效果最高的siRNA,构建NF-κBp65-shRNA的表达载体,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM和siPORTTM XP-1两种转染系统转染细胞,比较其抑制效果.选择抑制效率较高的转染系统,优化转染条件,从mRNA和蛋白至水平检测NF-κBp65抑制效果,从而建立最优的NFκBp65的缺陷模型.结果：选择T7体外转录抑制效果做好的片段,构建NF-κBp65-shRNA的表达载体,发现采用siPORTTM XP-1转染系统的抑制率比脂质体Lipofectamine2000TM高.优化转染条件,发现质粒浓度为0.4ug,转染48h时NF-κBp65的mRNA抑制率较高,为62.9％.Westernblot检测蛋白质表达水平下降了约60.2％.结论；RNAi技术可以有效的抑制16HBE细胞中NF-κBp65表达,该模型的建立有利于后续的实验的进行.
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