【摘 要】
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目的 构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控,表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中进行表达验证.方法 选用慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG.(1)在Genbank上查找hTERTp序列,设计PCR引物,从人结肠癌标本中提取目的片段hTERTp,构建pLEGFP-hTERTp,将本课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp应用HindⅢ和Pstl双酶切
【机 构】
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西安交通大学医学院第一附属医院普外科 710061
【出 处】
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中华医学会第十七届全国外科学学术会议
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目的 构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控,表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中进行表达验证.方法 选用慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG.(1)在Genbank上查找hTERTp序列,设计PCR引物,从人结肠癌标本中提取目的片段hTERTp,构建pLEGFP-hTERTp,将本课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp应用HindⅢ和Pstl双酶切, hTERTp连入线性化的pLEGFP-5HRE-CEAp,构建pLEGFP-5HREhTERTp; (2)以pLEGFP-5HRE-hTERTp为模板,设计PCR引物,提取5HRE-hTERTp基因序列,同时通过Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体上的CMV启动子使pLVX-EGFP-3FLAG线性化,同源重组构建pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体;(3)以本课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体为模板,设计PCR引物,提取CDX2基因序列,同时通过EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切切除pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体上的EGFP使其线性化, 同源重组构建pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体;(4)应用 pLVX-5H RE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的 启 动 功 能 ; (5) 应 用pLVX-5H RE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体及pLVX-5H RE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,免疫组化观察FLAG蛋白的表达鉴定此载体的表达情况.
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