【摘 要】
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目的：禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起鸡的肝炎-脾脏肿大综合征,近年来,在我国鸡群中呈现流行趋势.HEV的ORF2蛋白是其主要的保护抗原,本研究利用同源重组技术构建并鉴定一株能够稳定表达HEV ORF2蛋白的重组马立克病毒(Mareks disease virus,MDV).方法：首先利用原核表达载体PET28a、真核表达载体pCDNA3.1构建表达HEV ORF2
【出 处】
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第五届全国禽病分子生物技术青年工作者会议
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目的：禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起鸡的肝炎-脾脏肿大综合征,近年来,在我国鸡群中呈现流行趋势.HEV的ORF2蛋白是其主要的保护抗原,本研究利用同源重组技术构建并鉴定一株能够稳定表达HEV ORF2蛋白的重组马立克病毒(Mareks disease virus,MDV).方法：首先利用原核表达载体PET28a、真核表达载体pCDNA3.1构建表达HEV ORF2基因的重组质粒.将重组质粒pET28a-ORF2转化宿主菌BL21,诱导表达ORF2融合蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.其次利用Western blot和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定HEV ORF2蛋白多克隆抗体的特异性.最终,利用Red E/T同源重组技术将HEV ORF2基因取代MDV meq基因缺失疫苗SC9-1的SORF2基因,构建并鉴定以SC9-1基因组REV LTR作为启动子表达HEV ORF2蛋白的重组MDV.结果：结果表明,制备的HEV ORF2蛋白多克隆抗体具有良好的特异性,经200倍稀释仍能够与转染pCDNA3.1-0RF2质粒的鸡胚成纤维细胞(Chick embryo fibroblast,CEF)发出亮绿色荧光,同时经Western blot试验显示与HEV ORF2蛋白发生特异性反应.PCR测序结果显示HEV ORF2基因成功取代SC9-1的SORF2基因,以HEV ORF2蛋白多克隆抗体作为一抗的IFA试验显示重组MDV发出特异性亮绿色,而SC9-1没有反应,同时利用本实验室前期制备的MDV SORF2蛋白多抗作为一抗,结果相反.病毒在CEF细胞上的复制曲线显示重组病毒与MDV SC9-1复制水平相似(P ＞0.05).结论：利用MDV基因缺失疫苗SC9-1基因组中的REV LTR作为启动子构建的表达HEV ORF2蛋白的重组病毒能够成功表达外源蛋白,并在体外稳定的复制.为进一步评价HEV ORF2基因重组MDV的免疫效果研究奠定基础.
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