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目的:三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一个重要分子亚型,约占乳腺癌的15%-20%。与其他乳腺癌亚型相比,TNBC患者发病年龄轻,侵袭性强,肺、肝、脑等器官转移率高,具有复发早、进展快、生存期短等特点,预后较差。雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体-2(HER-2)阴性为TNBC的免疫组化典型特征,缺乏特异性标志物作为有效的治疗靶点,对内分泌和靶向治疗均不敏感。因此,探索新的治疗靶点,开展多位点靶向药物治疗,是目前TNBC研究的热点和难点。表皮生长因子受体(EGFR)是与乳腺癌进展和预后不良相关的生长因子受体之一。大多数TNBC中存在EGFR阳性表达,阳性率可高达50%-80%,表皮生长因子(EGF)的磷酸化可以在与EGFR相互作用后发生,随后激活下游PI3K/AKT信号通路,导致肿瘤细胞的增殖,分化和转移,加速TNBC的发生发展。因此,对于EGFR阳性表达的TNBC,EGFR是一个极具吸引力的潜在治疗靶点。虽然西妥昔单抗等针对EGFR的分子靶向药物已应用于乳腺癌的临床治疗,但是单独应用的有效率不高,且耐药问题普遍存在,提示EGFR阳性乳腺癌中可能存在其它分子影响EGFR信号通路的活化。目前,EGFR阳性TNBC(EGFR~+TNBC)的治疗策略逐渐发展成为乳腺癌研究领域的重要课题之一。EVI-1蛋白,又称MDS1和EVI-1复合体基因座蛋白,属于锌指转录因子。在正常机体发育过程中,EVI-1促进细胞增殖和血管生成。EVI-1基因的过度扩增或过度激活经常导致肿瘤发生。EVI-1在多种恶性肿瘤中表达上调,且与肿瘤的不良预后有关。研究发现EVI-1在胰腺癌、结肠癌、脑胶质瘤、乳腺癌等多种实体肿瘤中高度活化高表达,发挥原癌基因的作用,其表达水平与预后呈负相关。EVI-1过表达可促进细胞增殖及抗癌细胞凋亡。在胰腺癌中,EVI-1过表达通过促进PI3K/AKT通路的活化,导致癌细胞增殖、侵袭,抑制凋亡。在乳腺癌中,EVI-1可能通过促进乳腺癌细胞生长、侵袭等相关基因的表达,发挥致癌作用。miR-206最初是从人和小鼠肌肉组织中克隆出来的,为22nt,编码基因定位在6号染色体。miR-206在乳腺癌中表达下调是2005年第一次通过mRNA芯片确定的。研究发现,对于TNBC细胞株MDA-MB-231,miR-206能明显抑制其增殖。miR-206在乳腺癌中主要发挥抑癌基因的作用,有可能成为乳腺癌新的治疗靶点。我们前期研究通过生物信息学软件分析发现,miR-206与EVI-1可能存在靶向调控关系。基础实验证实,miR-206通过负性调控转录因子EVI-1的表达水平,间接调控乳腺癌干细胞的生物学行为。对于EGFR~+TNBC,上述结论有待在不同水平加以证实,如在相应TNBC组织、TNBC细胞系中进行验证,并阐明其作用机制。目前EVI-1在EGFR~+TNBC中的表达尚不清楚,EVI-1表达改变对EGFR~+TNBC发生发展的作用机制尚未阐明。本研究检测EVI-1在EGFR~+TNBC组织中的表达,分析EVI-1表达与其临床病理特征及预后的关系。利用生物信息学预测分析EVI-1是miR-206的下游靶基因,并采用双荧光素酶基因报告系统进行验证。通过体外实验,深入探讨miR-206及EVI-1改变对EGFR阳性的TNBC生物学行为的影响及相关分子机制。研究方法:1、采用免疫组织化学染色方法检测88例EGFR~+TNBC组织及癌旁组织中EVI-1的差异表达,并分析EVI-1与EGFR~+TNBC的临床病理特征因素及预后的作用关系。2、采用生物信息学软件对miR-206的靶基因进行初步预测筛选。利用DAVID及Gene Ontology数据库对miR-206靶基因从生物学过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)三方面进行基因功能富集分析,利用KEGG数据库进行生物信号转导通路富集分析,初步探索miR-206靶基因参与调控乳腺癌的关键信号通路。运用双荧光素酶报告基因系统在体外验证miR-206与靶基因的结合作用。3、通过miR-206转染EGFR~+TNBC细胞(MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞)并验证转染效率,确定优势细胞株进行后续实验。以miR-206 mimics和miR-206inhibitors、阴性对照载体(NC)、EVI-1基因沉默表达载体(shEVI-1)单独或联合转染EGFR~+TNBC细胞,加用EGFR通路抑制剂AG1478处理细胞,观察对细胞生物学行为及EGFR/PI3K/FOXO信号通路关键蛋白的影响。CCK-8实验检测上述细胞的增殖活性的影响;Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡;Western blot检测EGFR/PI3K/FOXO信号通路关键蛋白和凋亡相关蛋白的表达。4、使用SPSS 17.0软件分析实验数据。使用ImageJ软件进行实验图像处理,并使用Graphpad软件绘制图形。计数数据通过行×列表的χ2检验或Fisher精确检验进行分析,Kaplan-Meier和Log-Rank检验用于生存分析,COX回归分析用于多变量生存分析。测试水平为α=0.05。结果:1、EVI-1在EGFR~+TNBC中的高表达率为59.1%(52/88),显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。EVI-1d的表达与病理类型、脉管癌栓、淋巴结转移、病理分期、Ki-67的表达相关(P<0.05)。生存分析显示,与EVI-1高表达组相比,EVI-1低表达组患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)显著延长(P<0.05)。与其他亚组相比,EVI-1、Ki-67双低表达与患者DFS和OS的延长显著相关(P<0.05)。2、通过Targetscan7.2和miRDB两个数据库对miR-206的靶基因进行初步预测,获得包括EVI-1在内的靶基因544个。预测结果显示miR-206可与EVI-1 3’UTR靶向结合,MECOM(即EVI-1)基因可能是miR-206的直接作用靶点。GO分析和KEGG通路富集分析显示miR-206靶基因主要分布在Hippo信号通路、Rap1信号通路、粘着连接及癌症通路等对乳腺癌发生发展起重要调控作用的通路。推测EGFR/PI3K/FOXO通路可能是与EGFR~+TNBC密切相关的信号通路。双荧光素酶报告基因检测系统验证了EVI-1 3’UTR与miR-206互补的位点直接靶向结合。3、1)CCK-8结果显示:与对照组相比,转染miR-206 mimics 24h后MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞增殖活性明显降低,MDA-MB-231细胞增殖抑制作用更强,转染效率更高(P<0.05)。选择MDA-MB-231细胞株进行后续实验。2)WB结果验证上调miR-206可抑制MDA-MB-231细胞中EVI-1蛋白的表达(P<0.05)。3)Transwell实验结果显示:与对照组相比,转染miR-206 mimics或shEVI-1后穿过Transwell小室膜的细胞数略减少(P<0.05);与miR-206 mimics组相比,加用AG1478穿膜细胞数明显减少,共转染miR-206 mimics及shEVI-1联合AG1478穿膜细胞数最少(P<0.05)。4)流式细胞术实验结果显示:与对照组相比,转染miR-206 mimics或shEVI-1组出现G0/G1细胞周期阻滞,细胞凋亡比例增加(P<0.05);与miR-206 mimics组相比,加用AG1478加强了上述作用,共转染miR-206 mimics及shEVI-1联合AG1478后上述作用最强(P<0.05)。5)Western blot实验显示:与对照组相比,miR-206过表达或EVI-1沉默组MDA-MB-231细胞中EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平均明显降低,p-FOXO表达减少,p-FOXO1/FOXO1比值降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达增高,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05);与miR-206 mimics组相比,miR-206过表达或EVI-1沉默基础上加用EGFR通路抑制剂AG1478对MDA-MB-231细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导作用进一步增强,共转染miR-206 mimics及shEVI-1联合AG1478对MDA-MB-231细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用最为明显(P<0.05)。结论:1、EVI-1在EGFR~+TNBC组织中大多数为高表达,在对应的癌旁组织的多为低表达或缺失表达。EVI-1表达与病理类型、脉管癌栓、淋巴结转移、病理分期、Ki-67升高均有显著相关性。EVI-1低表达与TNBC患者的DFS和OS延长有关,EVI-1低表达是EGFR~+TNBC的独立预后保护因素。联合检测EVI-1、Ki-67的表达可以作为判断EGFR~+TNBC预后的重要指标。2、EVI-1 3’UTR可与miR-206直接靶向结合,EVI-1是miR-206的下游靶基因。miR-206参与调控多种靶基因,在乳腺癌发生发展及增殖侵袭进程中发挥重要作用。miR-206靶基因参与调控多种信号通路,EGFR/PI3K/FOXO通路可能是与EGFR~+TNBC密切相关的信号通路。3、特异性增强miR-206可下调EVI-1在EGFR~+TNBC细胞系中的表达;miR-206过表达或EVI-1沉默可抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,抑制EGFR/PI3K/FOXO信号通路关键蛋白的表达,降低PI3K/AKT蛋白磷酸化水平,降低FOXO1磷酸化水平,上调FOXO1转录活性,最终影响凋亡相关蛋白的表达。加用EGFR通路抑制剂具有类似的协同作用,共转染miR-206 mimics及shEVI-1联合AG1478组上述作用最强。miR-206抑癌作用的分子机制可能是通过负性调控EVI-1影响EGFR/PI3K/FOXO信号通路及凋亡相关通路,进而调控其下游基因的表达来发挥相应的生物学功能。以上干预的关键因子可能是EGFR~+TNBC潜在的治疗靶点。