肝细胞生长因子基因修饰的脐带间充质干细胞促进鼻黏膜创伤愈合的实验研究

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目的探讨过表达肝细胞生长因子(HGF)的入脐带间充质干细胞(hUCMSCs)对鼻黏膜上皮和兔鼻窦黏膜机械损伤模型的修复作用,为促进鼻内镜术后损伤的黏膜上皮修复提供新思路。方法 1、通过酶消化法和组织块培养法分离hUC-MSCs,按照间充质干细胞国际标准,倒置显微镜下观察细胞形态学,CCK-8法监测细胞增殖能力,流式细胞术检测间充质干细胞表面标记物,体外成骨、成软骨、成脂定向诱导检测hUCMSCs的多向分化潜能;2、使用腺病毒载体构建含有HGF基因的重组腺病毒(Ad-HGF),以MOI=100转染hUCMSCs(HGF-MSCs),PCR以及ELISA鉴定HGF在HGF-MSCs中的表达;3、体外原代培养鼻上皮细胞,建立鼻黏膜上皮机械划痕模型,利用hUCMSCs以及HGF-MSCs的条件培养液观察对上皮愈合能力的影响,并采用CCK-8法检测其能否促进上皮细胞增殖。3、建立兔上颌窦黏膜机械损伤模型,实验组24小时内经静脉注射GFP-MSCs、HGF-MSC以及Ad-HGF损伤部位直接注射,对照组注射等量生理盐水,4天、8天、28天每组处死3只兔子,记录上颌窦造口的孔径,并采用免疫荧光等方法检测兔鼻窦黏膜愈合情况、hUC-MSCs的分布及其在体内的分化,扫描电镜检测新生鼻黏膜纤毛覆盖率及纤毛形态,ELISA法检测HGF以及纤维化标记物TGF-beta1。结果 1、hUCMSCs条件培养液可促进鼻上皮细胞增殖、划痕愈合,通过过表达HGF能够增强这种效应。2、实验组黏膜缺口面积小于对照组、Ad-HGF注射组,差异具有统计学意义(P<0.05),组织切片见实验组黏膜水肿较对照组轻,免疫荧光见hUC-MSCs在新生黏膜中有存活,大部分位于固有层,部分能表达上皮角蛋白和纤毛标记物β-Tubulin蛋白,实验组纤毛覆盖率和形态均优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。另外,在HGF-MSCs组中,其胶原沉积明显下降,并且能够降低TGF-beta1在损伤组织中的浓度。结论成功从人脐带中分离培养hUC-MSCs,并且符合国际标准;hUC-MSCs能在体外促进鼻黏膜上皮增殖、划痕愈合,体内移植能促进黏膜的愈合,部分能分化为上皮和纤毛细胞。HGF-MSCs不仅具有增强以上效应还能降低组织修复时胶原沉积以及纤维化程度。
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