目的杜氏型肌营养不良/贝克型肌营养不良(Duchenne/Becker muscular atrophy,DMD/BMD)是临床常见的X连锁隐性遗传病,男性发病率大约为1/3500。DMD基因突变是DMD/BMD的发病原因。DMD基因是人体中已知最大的基因,包含79个外显子,70%-80%的突变为单个或多个外显子的缺失和重复,另有20%-30%的突变为点突变、碱基缺失、碱基插入或其他形式的突变。多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA)能够通过两个反应检测DMD所有79个外显子的拷贝数变化,是临床检测DMD基因外显子缺失和扩增的常规方法。但是,使用MLPA检测DMD基因外显子缺失或重复存在潜在的错判风险,尤其是对单一外显子异常的结果。本研究的目的在于讨论MLPA检测针对DMD基因可能发生的假阳性,并且探讨临床遗传检测中面临的不确定性风险。方法与结果从2006年以来,我们总共完成针对DMD基因的MLPA临床检测465例,其中男性样本330例。在所有465例样本中,MLPA检出阳性患者共313例,检测阳性率为67.3%;在所有330例男性样本中,MLPA检出阳性患者共248例,检测阳性率为75.2%。值得注意的是,我们对所有MLPA提示单外显子异常的结果进行了验证,其中有9例结果与MLPA不一致。这9例结果无一例外,均为事实上是在外显子内缺失数个碱基,却被MLPA判断为单外显子缺失(男性)或杂合缺失(女性)。这种结果判断的不一致最大的可能是因为突变位点影响了MLPA探针的结合效率,从而导致出现错判。讨论在这9例不相符的结果中,其中6例样本为MLPA结果提示异常,以正常男性样本为对照,男性受检者异常外显子数值显示为0.44-0.47,女性受检者异常外显子数值显示为0.49-0.69;另外3例男性样本MLPA结果显示为0,但是定量PCR结果提示该外显子不存在缺失。对以上9例样本进行桑格测序,均检出对应外显子中存在数个碱基的缺失。更特别的是来自于一个家系的2例样本a和b。该家系具有典型的X连锁隐性遗传特征,家系中有数名男性患者被诊断为"肌营养不良",但是均未做基因检测且都已死亡。在家系关系中,a是b的姨姥姥,且生育过男性患儿。因此我们对a进行了MLPA检测,提示其44号外显子杂合缺失。我们进一步对a的样本进行了两次定量PCR检测,检测结果一次位于灰区,而一次结果提示杂合缺失。因此,我们判断MLPA的检测结果是正确的。接下来,由于b有生育要求,我们对b同样进行了MLPA检测,结果与a一致。但是后续多次重复定量PCR验证结果均提示b样本不存在44号外显子缺失。由于b的结果与a不一致,所以我们对这两个样本进行了测序,结果确定该两个样本在44号外显子上均存在c.6385 6388AAGAdel的杂合突变。源于MLPA检测的技术原理,MLPA的检测结果可能出现假阳性。通过PCR和定量PCR对MLPA单外显子异常结果进行验证是一个可行的方法。如果两种检测结果一致,那么能够帮助我们确信MLPA的检测结果。但是,这个案例提供了一种额外的可能。虽然这是孤立的案例,然而它所提示的内容是,与MLPA一样,所有生物学检测,包括PCR、定量PCR等都存在潜在的不确定性。不同的突变对MLPA探针结合的效率,对定量PCR及PCR引物结合的影响都无法评估,这种不确定性对实验结果的准确判断是一个巨大的挑战。就这个家系来说可能从理论上来说,如果突变位点因为影响MLPA结合而导致MLPA出现假阳性,那么同样可能因为影响PCR和定量PCR而导致结果不正确。从这个角度,即使其他两种方法的验证结果与MLPA一致,我们又能在多大程度上保证检测结果一定是正确的?对于临床遗传检测来说,面对的是每一个特定的患者,而遗传物质是不会改变的,一份临床遗传检测结果只有正确和错误两种可能。通过我们对近500例DMD基因MLPA检测的验证结果以及这个特别的案例,我们认为在临床检测过程中应充分意识到检测可能存在的不确定性。这种不确定性并不单纯存在于MLPA检测中,而是存在于所有遗传检测中,尤其是随着高通量测序等技术的应用,海量数据将大大推升遗传检测的不确定性。在临床实践中,要多考虑到一些罕见的可能,这样既有利于全面分析问题,也有利于避免原本可能避免的临床错误。