论文部分内容阅读
目的:本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白口服重组减毒猪霍乱沙门氏菌活载体疫苗株。方法:PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因将其插入到表达载体pYA3493中,构建重组质粒pYA 3493-dORF5.将重组质粒电转入减毒猪霍乱沙门氏菌基因缺失株(缺失crp,asd基因),获得PRRSV ORF5基因减毒猪霍乱沙门氏菌ΔcrpΔasdC78-1(pYA-dORF5)重组菌.该菌株保留了在DAP阴性环境中生存的能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及果糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度低于强毒株C78-1,而与ΔcrpΔasdC78-1相比变化不明显;在体外连续传代能够稳定遗传dORF5目的基因片段.Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;通过口服途径与强毒株C78-1及猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500相比,ΔcrpΔasdC78-1(pYA-dORF5)毒力分别下降492倍和1.3倍.结果与讨论:随着分子生物技术的发展,利用胞内菌携带外源基因已引起了人们的广泛的关注.目前,质粒平衡致死系统已被应用到表达多种外源蛋白基因的尝试中.质粒平衡致死系统的出现解决了外源质粒不能持续遗传这一弊端.该系统的原理是将外源质粒插入含有与活菌载体营养缺陷的互补基因的质粒中,从而实现外源基因的持续表达.成功构建了ΔcrpΔasd C78-1缺失株,该缺失株的生长必需外源的DAP(二氨基庚二酸),进一步的生物学特性研究表明,其血清型与亲本菌C78-1一致,且能够稳定遗传crp基因和asd基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比明显改变.asd基因缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁,最终溶菌死亡.同时,由于哺乳动物组织中不含DAP,因此突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内均被降解.本研究构建的PYA-ORF5质粒含有asd基因,将其电转化ΔcrpΔasd C78-1后,可与ΔcrpΔasd C78-1形成互补,丢失PYA-ORF5的细菌则不能存活.ORF5基因编码的GP5蛋白的生物学功能非常重要,主要在病毒感染、细胞结合及病毒吸附中起作用,也是淋巴细胞增生性应答的靶点和PRRSV重要的中和抗原,在诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的过程中起重要作用.进一步的研究表明,ΔcrpΔasd C78-1(PYA-ORF5)在体内外均能够稳定分泌表达GP5蛋白,同时,western blotting检验也证实,该GP5蛋白具有较好的反应原性.本研究以减毒沙门氏菌作为活载体成功表达了PRRSV GP5蛋白,为PRRS新型核酸疫苗的研发提供了理论依据.