【摘 要】
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出于安全需要,人用生物制品不能有造成潜在健康危险因素的存在.世界卫生组织最新标准提出,疫苗生产用的任何传代细胞都必须没有外源性病毒,尤其是逆转录病毒的污染.最近,一种
【机 构】
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上海生物制品研究所细胞与分子生物实验室,上海200052上海生物制品研究所质保部,上海200052上海生物制品研究所细胞与分子生物实验室疫苗二室,上海200052
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出于安全需要,人用生物制品不能有造成潜在健康危险因素的存在.世界卫生组织最新标准提出,疫苗生产用的任何传代细胞都必须没有外源性病毒,尤其是逆转录病毒的污染.最近,一种超敏感的逆转录酶反应,我们称之为产物增强性逆转录酶反应(PERT)或建立在PCR基础上的逆转录反应(PBRT),可用来检测到单个逆转录病毒粒子中的微量逆转录酶活性,此反应的敏感性是常规逆转录酶检测方法的106倍.我们在国外文献报道的基础上建立了一种单管一步PERT(STOS-PERT)法,Ampliwax的应用可以把逆转录和PCR反应在同一个微量离心管中分隔开,反应的效率和重复性更高,而反应的的敏感性却不受影响.此外,在逆转录步骤中加入肝素可以完全抑制PERT反应中由于细胞凋亡所释放的细胞聚合酶(如DNA聚合酶α、γ等)引起的假阳性结果.我们应用调整后的STOS-PERT法分析了多种细胞品系,结果显示,大多数哺乳动物细胞(MRC-5,Vero,WISH,2BS,RK-13,MDCK等)的细胞上清液为PERT阴性,而细胞裂解液所呈现的PERT弱阳性,则是由于细胞中DNA聚合酶所引起的缘故,但这种假阳性结果可被肝素抑制.而鸡起源细胞,无论是来自鸡胚纤维原还是来自SPF级鸡胚的尿囊液,杂交瘤细胞SP2/0等都含有确定的逆转录酶活性,且不能被肝素所抑制.总之,本文所描述的改进后的STOS-PERT方法具有高度敏感性和特异性,可方便的区分细胞中真实的逆转录酶活性和真核细胞DNA聚合酶引起的RTase-1ike活性,操作简便、快速,可用于疫苗生产用细胞基质中微量逆转录病毒污染的筛查.
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