【摘 要】
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目的 建立一种满足临床需求的高纯度,高扩增效率和高杀瘤活性的自然杀伤细胞(NK细胞)的方法.方法 无菌采集20例志愿者外周血,每份80ml,肝素抗凝.Fieoll密度梯度离心法分离单个核细胞,利用Stemcell公司免疫磁珠分选磁极和NK细胞分选试剂盒(负选法)进行NK细胞分选.分选后的NK细胞用无血清培养基进行培养,经5ug/mL的CD3单克隆抗体(OKT-3),0.5ug/mL的CD28单克隆
【出 处】
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广东省医学会第四届细胞治疗学学术会议
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目的 建立一种满足临床需求的高纯度,高扩增效率和高杀瘤活性的自然杀伤细胞(NK细胞)的方法.方法 无菌采集20例志愿者外周血,每份80ml,肝素抗凝.Fieoll密度梯度离心法分离单个核细胞,利用Stemcell公司免疫磁珠分选磁极和NK细胞分选试剂盒(负选法)进行NK细胞分选.分选后的NK细胞用无血清培养基进行培养,经5ug/mL的CD3单克隆抗体(OKT-3),0.5ug/mL的CD28单克隆抗体,50 ug/mL的重组人纤维连接蛋白的激活后,在400 IU/mL的IL-2,40 ng/mL的IL-15,10 ng/mL的IL-21的共同刺激下进行大规模扩增.收集培养14天的细胞,流式细胞术进行NK细胞表型鉴定；与肿瘤细胞共培养,通过CCK-8法测定杀瘤效果；取细胞培养液,ELISA方法检测分泌γ-干扰素的水平.结果 外周血经密度梯度离心后可得到1.46±0.36×108个单个核细胞,经流式细胞术分析有19.38±1.79％的细胞具有NK细胞的表型(CD3-,CD16+,CD56+).经免疫磁珠分选后可得1.24±0.21 × 107个细胞,有95.12±2.35％的细胞具有NK细胞的表型.经过14天的培养后可得到2.52±0.71×109个NK细胞,扩增倍数大于200倍,扩增后的细胞90.98±2.57％以上以上具有NK细胞的表型.NK细胞在体外对K562细胞株的杀伤率为91.2±3.44％(效靶比为10∶1)和71.3±2.71％(效靶比为5∶1),对PANC-1细胞株的杀伤率为57.97±2.91％(效靶比为10∶1)和41.33±2.23％(效靶比为5∶1).ELISA方法检测NK细胞分泌γ-干扰素的水平为310±28pg/ml.结论 利用免疫磁珠分选法分选后扩增得到的NK细胞,具有纯度高,扩增效率好,杀瘤作用明显的优势,具有广阔的临床应用前景.
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