【摘 要】
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采用黄牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的死精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对黄牛精子胞质内注射(ICSI)介导转基因效果的影响。
【基金项目】
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国家“863”高科技研究发展计划项目(2007AA100505;2008AA10Z160);广西科技攻关项目(桂科转0718005-3A);霍英东教育基金(111034)
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采用黄牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的死精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对黄牛精子胞质内注射(ICSI)介导转基因效果的影响。结果表明:线性pEGFP-N1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL、250μg/mL两组(19.8%,16.7%VS 7.9%,1.4%,p<0.05)。以冻融、TritonX100、超声波三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率(24.7%)最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组(41%VS20.5%,P<0.01);当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异(p>0.05),但二者之间胚胎的基因表达率差异显著(46.83%VS 28.57%,p<0.05)。以上结果表明:(1)黄牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA影响胚胎发育;(2)精子质膜是阻碍外源DNA与黄牛精子结合的主要因素,冻融精子质膜破损法能有效破损精子质膜,有利于外源DNA与精子的结合,提高转基因效率;(3)注射台温度对黄牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但影响黄牛ICSI介导转基因的效果。
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