目的：建立二重实时荧光定量PCR方法，用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。 方法：根据结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特殊基因序列，设计了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针;对反应条件和试剂浓度进行优化，建立了能够同时检测鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR方法，对建立的实时荧光定量PCR方法的敏感性和特异性进行了检测。应用该方法对保存的临床样品进行二重荧光定量PCR检测。 结果：所建立的方法特异性好，对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的检测敏感性均达到10个模板拷贝数，比常规PCR敏感性高100倍：抗干扰能力强，对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌不同模板浓度进行组合，仍可有效地同时检测出这两种细菌。对50份PPD检测阳性的牛的临床样品进行二重荧光定量PCR检测，结果结核分枝杆菌阳性的临床样品有6份，牛分枝杆菌阳性的临床样品有1份，其它均为阴性。 结论：建立了用于检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重荧光定量PCR法，该方法特异、敏感、快速、可定量，对检测鉴别区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌有重要意义。