【摘 要】
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对7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因进行定向进化的初步研究,确定易错PCR条件、优化克隆连接方法、建立基于48微孔板高通量筛选模型.利用易错PCR技术对Lxyl-p1-2基因
【机 构】
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天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室,中国医学科学院北京协和医学院药物研究所,北京 100050
【出 处】
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中国菌物学会第四届全国药用真菌学术研讨会
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对7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因进行定向进化的初步研究,确定易错PCR条件、优化克隆连接方法、建立基于48微孔板高通量筛选模型.利用易错PCR技术对Lxyl-p1-2基因进行随机突变,比较不同浓度Mg2+进行易错PCR,每组随机挑取10个克隆进行测序.序列分析表明：在Mg2+浓度为7 mmol/L条件下,碱基平均突变率为0.12％,即对于Lxyl-p1-2基因(2.4 kb)来说,每个基因序列平均有3个碱基突变,达到构建突变文库的频率要求,选择该条件作为易错PCR条件.利用in-fusion技术将Lxyl-p1-2突变基因克隆到pPIC3.5K载体中,获得大量重组突变质粒.该研究优化了in-fusion连接反应中基因片段和载体片段的摩尔比,并探讨了基因片段与载体片段间同源序列长度对in-fusion连接效率的影响.试验结果表明：基因片段与载体片段的摩尔比最佳梯度为5∶1；同源序列长度的选择成为影响in-fusion连接效率的关键因素之一.当同源序列长度为100 bp时连接效率达到最大值,且显著高于同源序列长度为15 ～ 50 bp的连接效率,此时阳性重组率提高至90％左右.与常规酶切-连接法相比,in-fusion法具有明显优势,同时将克隆周期由3～4d缩短为1～2 d.挑取单菌落,在48微孔培养板上进行培养、诱导表达2d后,取菌液进行酶活测定(底物PNP-Xyl).以野生型为例,β-木糖苷酶的酶活OD405均数μ=3.415,其数据组标准差为σ=±0.078,数值符合正态分布的原理,建立统计学野生型均数分布范围和48微孔板高通量筛选,为后续突变体筛选提供基础.
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