【摘 要】
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CRISPR/Cas9基因编辑技术是基于细菌或古细菌CRISPR介导的获得性免疫系统衍生而来,由sgRNA通过碱基互补配对识别靶标DNA序列,指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA,诱发同源重组或非同源末端链接,进而实现在目的DNA上进行编辑.CRISPR/Cas9技术具有操作简便、高效、特异性强、可同时操作多个基因等特点,已经广泛应用于多个物种中.由于其可进行精确的遗传编辑,从而加速家畜的遗传改
【机 构】
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西北农林科技大学动物科技学院 陕西杨凌 712100
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CRISPR/Cas9基因编辑技术是基于细菌或古细菌CRISPR介导的获得性免疫系统衍生而来,由sgRNA通过碱基互补配对识别靶标DNA序列,指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA,诱发同源重组或非同源末端链接,进而实现在目的DNA上进行编辑.CRISPR/Cas9技术具有操作简便、高效、特异性强、可同时操作多个基因等特点,已经广泛应用于多个物种中.由于其可进行精确的遗传编辑,从而加速家畜的遗传改良,已经在农业和生物医药方面得以应用.然而,这种方法在大型家畜中应用所表现出的适用性和高效性并没用被深入的研究.本研究选择绒肉兼用型品种陕北白绒山羊为试验动物,针对MSTN基因(肌肉抑制素基因,抑制肌肉生成)和FGF5基因(抑制毛囊发育及绒毛生长)分别各设计两条sgRNA,通过将Cas9 mRNA与sgRNA共同注射到山羊1细胞期胚胎中,我们成功地得到了单基因或多基因敲除的基因修饰绒山羊.具体做法为：对79只供体绒山羊母羊进行超数排卵、同期发情和人工授精处理,通过手术获得受精卵,在受精卵发育的1细胞期显微注射混合的MSTN和FGF5基因sgRNA和Cas9至胞质中,培养24h后移植至137只供体绒山羊母羊中,成功获得98只羔羊,其中基因编辑羔羊26只,产后存活19只至今.在培养的山羊成纤维细胞中,MSTN基因和FGF5基因的打靶位点均实现了突变,靶向效率高于60％.与此同时,在98只获得的羔羊中,MSTN基因和FGF5基因的靶向效率分别为15％和21％,两个基因同时敲除的效率为10％.我们分别在成纤维细胞中、死胎的体组织以及性腺组织(睾丸和卵巢)中对目标突变以及脱靶突变进行了仔细的检测分析,证明CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在大动物中对多个基因的多个位点共同进行编辑修饰.我们进一步证实了CRISPR/Cas9基因编辑技术的实用性,MSTN基因和FGF5基因敲除的Cas9修饰山羊体现出了预期的表型.例如,FGF5基因敲除绒山羊的羊绒长度显著增加,但并未影响羊绒的细度,表明对FGF5基因的定向修饰得到了期望的绒山羊表型.随后,利用H&E染色、免疫组化、透射电镜、qPCR、WB等方法分别从组织形态学和遗传学水平验证了FGF5基因编辑绒山羊在表型水平确实存在差异.此外,利用生殖细胞特异标记因子-Vasa在基因编辑羔羊睾丸组织检测到生殖细胞的存在,证明了经过编辑修饰的等位基因同样具有遗传性,可以作为育种材料用于后续育种.通过与在猪、绵羊等其他动物中进行的基因编辑研究相比,我们的结果证实了CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为一种强有力且有效的基因编辑工具用于家畜育种.
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