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[目的](1)利用X线梯度照射法筛选建立人鼻咽癌放射抗拒细胞,为研究放射抗拒机制提供可比性的成对细胞。(2)通过测序平台,与已知数据库进行比对,从鼻咽癌放疗抵抗和亲本细胞RNA中筛选出差异表达microRNA和mRNA;通过生物信息学分析预测鼻咽癌放疗抵抗相关靶点和机制通路,为放疗抵抗相关基因表达及其转录后调节提供更直接的科学线索。(3)细胞学、组织学实验进一步验证表达谱中miRNA和mRNA的表达及其鼻咽癌生物学影响,探索有效干预靶点。[方法](1)建立鼻咽癌放疗抵抗细胞:应用X射线梯度照射的鼻咽癌CNE-2细胞系筛选出放疗抵抗细胞CNE-2-Rs,CCK-8法检测放射后细胞生存率差异,应用细胞克隆形成试验检测细胞的放疗敏感性,细胞增殖试验检测细胞放射后增殖能力差异。(2)鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA、mRNA差异表达谱的建立:将建立的放疗抵抗细胞与其亲代细胞提取RNA,通过IlluminaHiseq2000深度测序系统检测,与已知数据库进行比对,从两样本RNA中筛选出差异表达miRNA和mRNA,构建相关差异表达谱。利用RNAhybrid软件将差异表达谱中的表达趋势相反的miRNA和mRNA进行生物学匹配,筛选出miRNA靶基因,将这些靶基因进行KEGG分析,预测可能的靶基因和信号通路。(3)qRT-PCR对miRNA表达谱中miRNA进行检测,调控miRNA及可能的靶基因在鼻咽癌细胞内的表达,通过CCK-8法检测放射后细胞生存率差异,应用细胞克隆形成试验检测细胞的放疗敏感性;对它们的下游靶基因进行筛选并通过转染质粒沉默相关基因确定其对鼻咽癌放疗抗拒的影响,荧光素酶报告基因的检测miRNA与靶基因间的直接靶向性。Western Blot检测上述指标表达改变后靶基因下游通路的改变情况。qRT-PCR、Western Blot在组织学上验证miRNA与靶基因在鼻咽癌中的表达相关性及在鼻咽癌临床参数中的意义。[结果](1)X线梯度照射可诱导建立鼻咽癌抵抗细胞:①不同放疗剂量下,CCK-8法检测细胞CNE-2-Rs的生存率高于CNE-2;②CNE-2-Rs放疗后的增殖能力高于CNE-2,放疗抑制率低于CNE-2;③细胞CNE-2-Rs集落形成能力强于CNE-2细胞,多靶单击模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线,相关指标均提示CNE-2-Rs较CNE-2具有放疗抵抗性,并具有统计学差异(P<0.05)。(2)建立鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱。①筛选出具有差异表达己知miRNA 192个(上调107个,下调85个,P<0.05),其中具有显著差异的miRNA 50个(Fold-change>1.00或Fold-change<-1.00,P<0.05;上调36个,下调14个)。②靶基因分析获得453个上调mRNA和517下调的mRNA,进一步的KEGG分析提示上调的预测靶基因富基于"分子黏附相关通路(CAMs)"等22条信号通路上;下调的靶基因富基于"Pathwavs in cancer"等15条信号通路上,这些通路均与肿瘤的发生发展相关。(3)miRNA相关功能学检测:①qRT-PCR对miRNA表达谱中miRNA进行检测,发现miR-324-3p、miR-185-3p、miR-93-3p等多个miRNA均下调,其中miR-324-3p下调最明显。在鼻咽癌细胞中上调和下调miR-324-3p,发现该miRNA的上调能增加鼻咽癌的放疗敏感性,下调能增加鼻咽癌的放疗抵抗性。②靶基因通路分析,miR324-3p靶向WNT信号通路的WNT2B基因;在鼻咽癌细胞中沉默WNT2B基因表达,鼻咽癌细胞放疗抵抗能力下降;上述转染细胞通过Western Blot检测发现WNT信号通路下游p-GSK-3β和β-Catenin均出现相应变化;荧光素酶报告基因检测提示miRNA-324-3p直接靶向WNT2B。③同时,miRNA-324-3p相对表达量在鼻咽癌组织中显著下调(P<0.001),WNT2B mRNA及蛋白相对表达量则显著上调(P均<0.001),三者表达水平均与鼻咽癌T分级、临床分期及淋巴结转移密切相关(P均<0.05),与患者性别、年龄无明显相关性(P均>0.05)。鼻咽癌组织中miRNA-324-3p与WNT2B mRNA及蛋白表达存在负相关性,WNT2B mRNA与蛋白表达存在正相关性(P均<0.05)。ROC曲线分析显示WNT2B mRNA及蛋白对诊断鼻咽癌具有较高的灵敏度和特异度。[结论](1)课题组通过梯度照射模式证实其可以增加细胞的放疗抵抗性。结果提示,在体外条件下这种筛选模式也可能筛选或诱导出放射抗拒的细胞,为放疗筛选放疗抵抗细胞提供了一个新的放疗筛选方案。(2)鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱的建立,提示miRNA参与了鼻咽癌放疗抵抗的形成,综合信息学分析提供了数个可能的富集生物过程和富集通路,提示鼻咽癌放疗抵抗的发生发展是一个多分子多机制多层面的调控网络。(3)miRNA及其靶基因可影响下游通路及鼻咽癌放疗抵抗能力,并可能成为鼻咽癌的敏感诊断指标及治疗靶点,为有效干预靶点的探索提供了新线索和方向。