论文部分内容阅读
癌症被认为是世界上最致命的疾病之一。人们普遍认为,早期发现癌症是降低实体癌症死亡率的最有效方法。因此,需要在可操作阶段诊断癌症。在癌症的诊治过程中,肿瘤标志物的早期鉴定和检测对于癌症患者的治疗及提高存活率至关重要。肿瘤标志物通常是癌症存在时可以在血液或尿液中发现的蛋白质,它们可以是癌细胞本身的产物,也可以是身体对癌症或其他疾病作出的反应。纤维蛋白是血液凝固级联的最终产物。纤维蛋白凝块不是在正常条件下形成的,它们通常伴随着几种病理状态,如心脏或脑梗塞、损伤、急性炎症、癌症侵袭和转移等。研究发现,在很多肿瘤间质中都有纤维蛋白的沉积。因此,纤维蛋白可以作为诊断和监测某些肿瘤生物的重要标志物。本工作以肿瘤标志物纤维蛋白为研究对象,利用CREKA可特异性识别研究对象的特性,建立了基于CREKA的、高灵敏和高选择性检测纤维蛋白的类酶联免疫法。全文分为以下四部分:一、基于功能化纳米金建立的类酶联免疫光度法检测纤维蛋白首先将链霉亲和素（SA）包被的纳米金颗粒（SA-AuNPs）作为功能化探针的基底,再将生物素修饰的G-四链体-hemin DNAzyme和可特异性识别纤维蛋白的CREKA结合到SA-AuNPs上,再以此为探针加入到含有纤维蛋白的酶标板上,显色体系ABTS-H2O2作为DNAzyme的底物,建立了一种新的ELISA检测方法,实现了对纤维蛋白的快速特异性检测。在优化的实验条件下,该方法检测纤维蛋白的线性范围为0.056-16.8 nM,线性回归方程为A=0.0956+0.0056 c（c为纤维蛋白浓度,nM）,相关系数R=0.9971,方法的检出限为0.014 nM。二、基于归巢肽CREKA和DNAzyme的类酶联免疫化学发法检测纤维蛋白采用了基于CREKA特异性识别纤维蛋白的类酶联免疫分析方法。将具有催化作用的G-四链体-hemin DNAzyme偶联到CREKA上,形成了DNAzyme-CREKA复合物,再将此复合物加入到含有纤维蛋白的酶标板上,利用luminol-H2O2化学发光反应,通过化学发光分析法测定纤维蛋白的浓度。此方法检测的灵敏度高,而且操作便捷。在适宜的实验条件下,该方法测得纤维蛋白在0.112-5.6 pM范围内显示出良好的线性关系,线性方程为ICL=10028.0+1690.9 c（c为纤维蛋白浓度,pM）,相关系数R=0.9975,检出限为0.056 pM。三、基于滚环扩增技术建立的类酶联免疫化学发光法高灵敏检测纤维蛋白首先将DNA偶联到CREKA上,基于DNA易被复制这一特点,利用RCA技术产生了长的、重复的G-四链体结构域链。当与hemin嵌合后,每个G-四链体部分都会变成G-四链体-hemin DNAzyme,实现了DNAzyme的大量富集,将此作为探针加入到含有纤维蛋白的酶标板上。这种DNAzyme的自身放大机制,再辅以催化反应luminol-H2O2体系的信号放大机制,进一步提高了检测纤维蛋白的灵敏度。在适宜的实验条件下,该方法检测纤维蛋白在1.68-168 fM范围内呈良好的线性关系,线性方程为ICL=15456.6+93.6 c（c为纤维蛋白浓度,fM）,相关系数R=0.9975,检出限为0.56 fM。四、基于功能化纳米金和滚环扩增技术建立的类酶联免疫法检测纤维蛋白提出了一种新的基于纳米金颗粒作为探针的固定载体,又结合RCA技术的ELISA方法去检测纤维蛋白。将生物识别分子CREKA和滚环扩增引物DNA修饰到纳米金上,再结合RCA技术,可得到大量重复的G-四链体结构链域,其与hemin结合实现了DNAzyme的富集。再将此探针与纤维蛋白结合,利用luminol-H2O2反应体系,可以间接测定纤维蛋白的含量。在优化的实验条件下,这种测定纤维蛋白的方法在1.4-112 fM范围内具有良好的线性关系,线性回归方程为ICL=52807.5+622.6 c（c为纤维蛋白浓度,fM）,相关系数R=0.9964,检出限为0.84 fM。