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研究目的:针刺是改善运动性骨骼肌损伤(exercise-induced muscle damage,EIMD)的有效手段,但其相关机制尚需进一步明确。内质网应激-自噬作为参与运动诱导肌肉损伤的重要环节,为研究针刺作用机制提供了新的切入点。本研究拟围绕GRP78、CRT、FAM134B和LC3的分子作用,观察针刺对大负荷运动后骨骼肌内质网应激-自噬反应的影响,探讨针刺修复EIMD的时程效应和分子机制,为针刺疗法改善EIMD提供新的科学依据。研究方法:(1)研究对象与分组:健康雄性8周龄SD大鼠88只随机分为对照组(C组,n=8)、运动组(E组,n=40)和运动针刺组(EA,n=40),其中E组和EA组根据干预后不同时相,又分为0h/12h/24h/48h/72h各5个亚组,共11个组别。(2)建立EIMD模型:采用一次大负荷运动建立运动性骨骼肌损伤模型,参考Armstong离心运动方案,使用小动物电动跑台对大鼠进行训练。E组和EA组在正式实验前进行适应性跑台训练3天,第1天坡度0°,速度16m/min,运动时间5min;第2天坡度0°,速度16m/min,运动时间10min;第3天休息,第4天起进行一次持续性下坡跑,坡度-16°,速度16m/min,运动时间90min。(3)针刺干预:运动后即刻对EA组大鼠予以针刺,固定器固定大鼠并对其双后肢进行消毒,用直径0.25mm的针灸针沿大鼠小腿三头肌纵向,从远端斜刺(进针角度约30°)穿过小腿三头肌肌腹,并留针2min。(4)取材与指标检测:按照各组对应不同时相,将大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,迅速分离比目鱼肌,用刀片迅速去除筋膜和肌腱,制备蛋白样品和冰冻切片;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测骨骼肌GRP78、CRT及内质网FAM134B、LC3蛋白表达,免疫荧光双染结合激光共聚焦观察FAM34B、LC3与CRT共定位情况。研究结果:(1)针刺对EIMD大鼠骨骼肌GRP78、CRT、FAM134B、LC3蛋白表达的影响。(1)GRP78蛋白表达统计结果显示:与C组相比,E组运动后各时相GRP78表达均显著升高;EA组在干预后0h显著升高,12h即开始回落,至72h均与C组水平无显著性差异。与E组对应时相相比,EA组GRP78表达在0h至72h均显著降低。(2)CRT蛋白表达统计结果显示:与C组相比,E组CRT表达在运动后0h至48h显著升高;EA组干预后0h即升至高峰,显著高于其他时相和C组水平。与E组对应时相相比,EA组干预后24h和48h具有显著性差异。(3)FAM134B蛋白表达统计结果显示:与C组相比,E组FAM134B表达在运动后0h至24h显著升高;EA组总体呈先升高后降低趋势,但各时相与C组水平均无显著性差异。与E组对应时相相比,EA组FAM134B均有所降低,在12h、48h和72h有显著差异。(4)LC3蛋白表达统计结果显示:与C组相比,E组运动后0h至72h LC3表达均显著升高;EA组仅在干预后0h显著升高。与E组对应时相相比,EA组LC3表达均有所降低,在12h、24h和48h有显著差异。(2)针刺对EIMD大鼠骨骼肌内质网FAM134B、LC3与CRT共定位的影响。(1)FAM134B与CRT共定位统计结果显示:与C组相比,E组在运动后0h至48h显著升高,EA组干预后0h至24h显著升高;与E组对应时相相比,EA组FAM134B与CRT共定位在干预后12h和48h显著降低。(2)LC3与CRT共定位统计结果显示:与C组相比,E组在0h至48h均显著升高;EA组干预后0h、12h、24h显著升高,运动后48h和72h则降低至与C组水平无显著性差异;与E组对应时相相比,EA组LC3与CRT共定位从0h至72h均显著降低。研究结论:(1)运动后针刺可使内质网应激标志蛋白GRP78、CRT表达下调,改善大负荷运动后骨骼肌内质网功能受损,缓解内质网过度应激。(2)针刺可明显下调运动后骨骼肌内质网自噬受体蛋白FAM134B和自噬标志蛋白LC3表达,FAM134B、LC3与CRT共定位亦相应减少。(3)针刺干预对运动后即刻至72小时期间,骨骼肌内质网功能、结构及内质网应激相关酶含量和蛋白表达表现出不同时程效应。(4)针刺改善EIMD可能通过下调CRT蛋白表达,抑制FAM134B和LC3转位,进而有效调节内质网应激-自噬反应来实现。