【摘 要】
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通过RT-PCR反应获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3上,通过转染293T细胞进行了瞬时表达验证.采用PCR定点突变技术,将其HA基因裂解位点的氨基酸组成由RKKR↓ GLF突变为RSSR ↓ GLF,使其具有低致病性AIV的分子特征,并构建了表达突变后HA基因的真核表达载体pcDNA-Hm.将pcDNA-H5和pcDNA-Hm分别与MuLV假病毒
【机 构】
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农业部动物检疫所,国家外来动物疫病诊断中心,青岛,山东,266032
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通过RT-PCR反应获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3上,通过转染293T细胞进行了瞬时表达验证.采用PCR定点突变技术,将其HA基因裂解位点的氨基酸组成由RKKR↓ GLF突变为RSSR ↓ GLF,使其具有低致病性AIV的分子特征,并构建了表达突变后HA基因的真核表达载体pcDNA-Hm.将pcDNA-H5和pcDNA-Hm分别与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T后,收集转染细胞上清,通过Western-blot和细胞感染性实验来研究假病毒的特性.用缺乏囊膜蛋白和已经证实可以形成MuLV假病毒的水泡性口炎病毒糖蛋白G作为对照.转染后形成假病毒进行裂解后进行Western-blot证明两种HA蛋白都能够整合到各自的假病毒颗粒表面,野生型的HA可以检测到三条带,分别与HA0、HA1和HA2大小相符,而突变后的HAm则仅能检测到一条带,与HA前体大小相符,说明其失去了裂解活性.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞后发现野生型的HA所形成的假病毒MuLV-H5具有感染性且具有泛嗜性,而突变后的HA所形成的假病毒则失去了感染性.因此,可以得出HA蛋白裂解位点的氨基酸组成不仅对H5亚型禽流感病毒的致病性有影响,对禽流感病毒侵入细胞也具有至关重要的作用.
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