为了进一步探索chIL2的生物学活性，设计一对包含Nde I和EcoRI限制性内切酶识别位点的引物，以本实验室保存的pMD-18T-chIL2重组质粒为模板进行常规聚合酶链式反应(PCR);分别对pET28a和PCR回收产物进行双酶切，酶切产物在T4 Ligase催化下连接过夜;连接产物转化Top10大肠杆菌进行重组质粒扩增，提取pET28a-chIL2重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌，IPTG低温(16℃)诱导目的蛋白表达，超声破碎细胞，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白;琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物大小约为450bp，与预期455bp一致;pET28a-chIL2重组质粒经双酶切鉴定、PCR扩增鉴定和碱基序列测定，结果均显示其正确性，chIL2基因碱基序列与GenBank中发表序列一致;转化获阳性重组子，挑取单菌并于37℃震荡培养至菌液OD600为0.6时，添加0.2mMIPTG并于16℃诱导表达4h。5OOOg离心3 min收集菌体细胞，超声破碎，12 000g离心10 min，得到上清和沉淀。上样缓冲液平衡镍柱，至蛋白纯化仪透过率T=100、吸光值O.5A=0;将Ni-NTA Agarose与离心上清混合并于翻转仪4℃翻转结合1h。结合完成后重装柱，50倍柱体积缓冲液快速淋洗，至吸光值为0。再分别用含有不同浓度咪唑(10 mM,30 mM,80 mM,250 mM)缓冲液进行洗脱，1mL/管收集各流出组分。SDS-PAGE电泳检测结果表明:重组目的蛋白经诱导在大肠杆菌中获得了高效表达，分子量大小约为18 kDa，目的蛋白含量占菌体总蛋白的28.5％。且以两种形式存在，即可溶形式存在于超声上清和包涵体形式存在于超声沉淀;30 mM咪哩浓度洗脱液能很好的洗脱与Ni-NTA Agaros。非特异结合的杂蛋白;;5个柱体积的80 mM咪哩浓度洗脱组分目的蛋白条带，带宽而深;250 mM咪哩浓度洗脱结果显示无目的蛋白条带，说明80 mM咪哩浓度洗脱液具有很好的目的蛋白洗脱能力。PBS(含10%甘油)透析、PEG20 000浓缩，得重组蛋白，纯度达90.1%，浓度为0.54 mg/ml。