【摘 要】
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实验室前期研究鉴定了稻瘟菌一个新的剪切因子MoCon2,pull-down实验及酵母双杂实验证明：MoPrp19与MoCon2存在互作。稻瘟菌MoPrp19与酿酒酵母中的RNA剪切体成分Prp19及人源的Prp19蛋白具有高度同源性。为了阐释MoPrp19参与剪切反应的分子机制,作者开展了MoPrp19原核表达载体构建、诱导表达及蛋白纯化工作,为后续蛋白互作实验和晶体生长实验奠定基础。
【机 构】
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中国农业大学植物病理系农业部重点实验室,北京 100193 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室
【出 处】
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中国植物病理学会2012年学术年会
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实验室前期研究鉴定了稻瘟菌一个新的剪切因子MoCon2,pull-down实验及酵母双杂实验证明：MoPrp19与MoCon2存在互作。稻瘟菌MoPrp19与酿酒酵母中的RNA剪切体成分Prp19及人源的Prp19蛋白具有高度同源性。为了阐释MoPrp19参与剪切反应的分子机制,作者开展了MoPrp19原核表达载体构建、诱导表达及蛋白纯化工作,为后续蛋白互作实验和晶体生长实验奠定基础。
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实验室前期鉴定了稻瘟菌中一个新的与致病性相关的APSES类转录因子Pcg2.酵母双杂交实验表明：Pcg2的C端与稻瘟菌中另一APSES类转录因子MoSwi6的C端存在相互作用.为了深入了解其在稻瘟菌中参与基因转录的分子机制，作者对Pcg2的C端561-715氨基酸进行了原核表达及纯化，并进行了晶体生长条件的筛选，以期获得其晶体并进行其三维结构的解析.
稻瘟菌中含有一个与人源通用转录辅因子PC4(positive cofactor 4)和酵母Sub1同源的蛋白MoSub1.为了深入地了解MoSub1在稻瘟菌中调控转录的分子机制，作者开展了重组MoSub1蛋白及其DNA复合物晶体结构解析的研究.首先，作者克隆了MoSub1的全长基因并将其在大肠杆菌中进行了表达，经过层析纯化，得到了可用于生长晶体纯度的重组MoSub1蛋白并解析了其晶体结构.
本实验室前期研究鉴定了一个新的同时具有转录激活和转录抑制功能的稻瘟菌转录因子Pcg2.为深入了解Peg2在稻瘟菌中参与基因表达调控转录的分子机制,作者对其转录激活区域和ANK domain (190-560AA)进行重组表达、纯化,为后续实验晶体生长及结构解析工作奠定基础.首先,PCR扩增编码目的蛋白的基因片段,双酶切连接表达载体pETM20,构建好表达载体 pETM20-Pcg2-M190-56
为了深入地了解稻瘟菌通用转录因子MoSub1在稻瘟菌中调控转录的分子机制,作者开展了MoSub1表达载体构建及重组MoSub1蛋白表达纯化工作,为后续实验其与核酸复合物制备、晶体生长及结构解析工作奠定基础。以稻瘟菌cDNA为模板,设计780F(5-CCATGGATATGACAAGTAAGAAACGCGC-3),780R(5-CTCGAGTCAGTCGGAACCAGAACCTTC-3)引物进行PCR