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目的:观察B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)对人淋巴瘤细胞株Raji细胞增殖、凋亡及凋亡相关通路的影响,探讨BLyS在B淋巴瘤细胞生长调控中的作用及可能的作用机制.
方法:1.细胞培养和传代:人淋巴瘤细胞株Raji培养于含体积分数为10％灭活胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的RPMI1640培养液中.置于37℃、5％CO2的培养箱中培养,每48-72小时传代一次,实验采用对数生长期细胞,台盼蓝染色拒染率均在95％以上.2.MTT法检测BLyS在Raji细胞增殖中的作用:取对数生长期的Raji细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)比色法检测(1)BLyS不同浓度组(0.25μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,)、不同时间组(24h,48h,72h)对Raji细胞增殖的影响.(2)BLyS不同浓度组(0.25μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,)、不同时间组(24h,48h,72h)和共刺激分子antMgM共同作用对Raji细胞增殖的影响.3.流式细胞术检测BLyS对化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡的影响:实验组加入相同浓度的VP-16(0.5μg/ml)和不同浓度(0.25μg/ml,0.5μg/ml和1μg/ml)的BLyS,应用流式细胞术检测BLyS对VP-16诱导的Raji细胞凋亡的影响.4.应用免疫细胞化学的方法定性观察BLyS影响化疗药物诱导Raji细胞凋亡过程中NF-KB、JNK、P38蛋白表达的变化.
结果:1体外细胞增殖实验(MTT)结果显示,BLyS对人淋巴瘤细胞株Raji细胞具有明显的促增殖作用.不同浓度(0.25μg/ml,0.5μg/ml和1μg/ml)BLyS处理Raji细胞24～72h后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度增大,差异有显著性(p＜0.05).且随着BLyS浓度的增加、作用时间的延长,OD值逐渐增大.即BLyS对Raji细胞的促增殖作用呈明显的剂量—效应和时间—效应依赖关系.不同浓度(0.25μg/ml,0.5μg/ml和1μg/ml)的BLyS和anti-IgM(10μl)共同作用也能促进Raji细胞增殖,差异有显著性(p＜0.05).将相同浓度的BLyS单独作用组与anti-IgM共同作用组两两比较发现:当BLyS浓度为0.25μg/ml时两组在24h、48h、72h时对B细胞的增殖作用无明显差异(p＞0.05).当BLyS浓度为0.50μg/ml、1.00μg/ml时与单独加入BLyS相比,anti-IgM共同作用组,B细胞的增殖幅度更大,差异有显著性(p＜0.05).说明BLyS与anti-IgM在刺激B淋巴细胞增殖上具有协同性作用.2流式细胞术检测结果显示:Raji细胞经化疗药物VP-16处理48小时后,流式细胞仪测得典型的亚二倍体凋亡峰,当加入VP-16同时加入BLyS后,细胞凋亡受到明显抑制,且随着BLyS浓度的增加,凋亡率逐渐降低.当BLyS的浓度为0μg/ml,0.25μg/ml,0.5μg/ml和1μg/ml时,Raji细胞凋亡率分别为18.32％,14.56％,7.39％,3.28％.说明BLyS能够抑制化疗药物VP-16诱导的细胞凋亡,且抑制作用呈明显的剂量依赖性.3免疫细胞化学检测结果显示:对照组Raji细胞中NF-κB染色强度呈弱阳性,弥漫分布于细胞质和细胞核.与对照组相比,单独加入VP-16,NF-κB表达无明显变化,当加入VP-16同时加入BLyS后,阳性细胞数量明显增加,核染色强度明显增强.对照组Raji中JNK、P38染色强度呈弱阳性,弥漫分布于细胞质和细胞核;VP-16处理后细胞核染色强度明显增强,阳性细胞数增加,当加入化疗药物同时加入BLyS,与单独加入化疗药物VP-16组相比,细胞染色强度减弱,阳性细胞数减少.
结论:1.BLyS促进人淋巴瘤细胞株Raji细胞增殖,且anti-IgM与BLyS在刺激B淋巴瘤细胞增殖上具有协同性作用.2.BLyS抑制化疗药物VP-16诱导的Raji细胞凋亡.3.BLyS抑制化疗药物诱导的细胞凋亡与增强NF-KB表达、抑制JNK、P38的表达有关.