【摘 要】
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研究背景:VSTM1-v2是通过免疫基因组学策略发现的新型经典分泌糖蛋白,其主要表达于免疫系统;体外研究发现,重组VSTM1-v2蛋白能促进Th17细胞分化和活化;利用VSTM1-v2转基因小
【机 构】
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北京大学医学部免疫学系,卫生部医学免疫学重点实验室; 北京大学人类疾病基因研究中心;
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研究背景:VSTM1-v2是通过免疫基因组学策略发现的新型经典分泌糖蛋白,其主要表达于免疫系统;体外研究发现,重组VSTM1-v2蛋白能促进Th17细胞分化和活化;利用VSTM1-v2转基因小鼠制备EAE模型发现,与野生型小鼠相比,VSTM1-v2转基因小鼠发病提前,且病情更重,提示其参与自身免疫病的发生和发展。基因工程方法是获得重组蛋白的重要手段之一,在哺乳动物细胞中可产生具有较高生物学活性的接近天然蛋白的重组蛋白。CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞是常用的工程细胞。目的:建立稳定、高效表达人VSTM1-v2-myc-his融合蛋白的CHO细胞,获得大量重组蛋白,为后续研究奠定基础。方法:从表达VSTM1-v2-myc-his融合蛋白的载体中扩增其c DNA片段,利用重叠PCR方法将此片段与Ig Gk信号肽序列(N端)连接融合,将其克隆到高效真核表达载体PMH3中(PMH3由杭州安瑞普生物科技有限公司提供)。利用电击转染的方法将该质粒转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆,Dot blot及Westem blot法鉴定其表达水平及免疫学活性。挑选高表达的一次克隆进行亚克隆化。细胞株扩大培养,悬浮驯化后进行无血清大批培养获得表达丰收液。结果:经核酸测序及酶切鉴定,高效重组VSTM1-v2表达载体构建成功。此载体转染CHO细胞后经2次克隆化获得至少10株高效稳定表达融合蛋白的基因工程细胞株,Dot blot分析显示其表达水平最高的细胞株24h贴壁表达量可达25mg/L。Western blot分析显示,其分子量约为55k Da,与预期融合蛋白大小基本一致。结论:获得了高效稳定表达VSTM1-v2的CHO细胞株。
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