【摘 要】
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近年来,以锌指核酸酶(ZFN)和TALEN为代表的人工构建的序列特异性核酸内切酶为基因组定点修饰技术带来了革命性的飞跃,使原来只能在小鼠、果蝇等极少数物种中实现的基因打靶迅速扩展到多种实验材料。本实验室在斑马鱼中建立了一系列基于TALEN的基因组靶向修饰技术,可用于制备多种类型、可稳定遗传的突变体,例如在特定位点高效诱导indel突变、通过同源重组实现基因敲入,还能够利用两对TALEN进行染色体大
【出 处】
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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编
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近年来,以锌指核酸酶(ZFN)和TALEN为代表的人工构建的序列特异性核酸内切酶为基因组定点修饰技术带来了革命性的飞跃,使原来只能在小鼠、果蝇等极少数物种中实现的基因打靶迅速扩展到多种实验材料。本实验室在斑马鱼中建立了一系列基于TALEN的基因组靶向修饰技术,可用于制备多种类型、可稳定遗传的突变体,例如在特定位点高效诱导indel突变、通过同源重组实现基因敲入,还能够利用两对TALEN进行染色体大片段的靶向删除或倒位,最大可达1 Mbp。最近,陆续在体外培养的人类细胞系以及斑马鱼、果蝇等一些模式生物中报道了一种更为简便的基因打靶技术。该技术利用了一种在细菌及古细菌中普遍存在的、称为CRISPR/Cas系统的防御机制。其中Cas9蛋白以及与其相互作用的向导RNA(guide RNA,简称gRNA)构成了一个简单的CRlSPR/Cas系统,Cas9经过密码子优化等改造之后,通过跟gRNA相互配合,能够靶向切割特异的双链DNA,从而造成基因组定点突变。gRNA通过碱基互补配对识别并结合靶序列,Cas9蛋白则作为核酸内切酶起作用。然而,作为一种非常有前途的新型基因组靶向突变工具,至今在斑马鱼中还未见报道获得可通过生殖细胞向后代遗传的突变体。同时,对这种基因打靶工具的特异性及其脱靶现象的分析也刚刚起步,尚无在个体水平检测其脱靶效应的报道。此外,也没有在斑马鱼中优化Cas9密码子的报道。我们首先检测了Cas9/gRNA在酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,th)基因造成的突变的种系传递情况,结果表明,4/14的F_0鱼携带可遗传的突变,嵌合率由12%到22%不等,显示Cas9/gRNA所产生的突变能够稳定遗传。随后,本实验室根据斑马鱼的密码子偏好性构建了一种新的Cas9表达载体(zCas9),结果显示它在斑鱼中比已报道的根据人类密码子优化的Cas9(human
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