论文部分内容阅读
目的:本研究根据电离辐射可诱导早期生长反应-1(Early growthresponse-1,Egr-1)基因启动子激活启动下游外源目的基因表达增强的分子机制,以及直接作用于细胞周期,抑制细胞分裂的抑癌基因p16的抗肿瘤作用,构建了含有放射敏感性启动子Egr-1和人源性的p16基因的重组表达质粒pEgr-p16,探讨不同剂量γ射线照射后诱导脂质体介导的p16基因在HeLa细胞和SMMC-7721细胞中的表达及抗癌作用。方法:将p16的全长cDNA插入质粒pcDNA3.1的多克隆位点,构建成pcDNA3.1-p16重组质粒;再以可被辐射激活的Egr-1启动子替换pcDNA3.1的CMV启动子,构建成pEgr-p16重组表达质粒。用脂质体介导转染入人肝癌细胞SMMC-7721和人的宫颈癌细胞HeLa转染后经48~72h,待细胞生长接近融合时按1:4的密度传代,继续培养至细胞密度达50%~70%融合,更换含有一定浓度的G418的培养液进行筛选,约10~20d后,可见有抗性克隆形成,经G418筛选扩大培养得到稳定表达p16的细胞株,细胞计数记录了照射转染pEgr-p16重组表达质粒的癌细胞的增殖效应,用RT-PCR的方法研究了经60Coγ射线照射后p16的转录水平,用流式细胞术对细胞周期和p16的蛋白表达水平的剂量效应和时程变化作了充分的研究,最后用流式细胞术对周期蛋白D和周期蛋白激酶4的表达也作了一些初步的研究。