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研究目的:蛋白同化制剂是兴奋剂检测中阳性率最高的违禁物质,多年来不断出现膳食补充剂中非法添加蛋白同化制剂的事件,为了减少国家队运动员兴奋剂误服事件的发生,提高膳食补充剂中蛋白同化制剂的检出能力是反兴奋剂工作的一个重点。蛋白同化制剂种类繁多、结构相似,并不断有新型未知人工合成类固醇的出现,都给兴奋剂的检测工作带来新的挑战,本工作通过已经获得标准样品的全扫谱图进行分析、归纳,结合相关文献总结出不同结构特点甾体的裂解规律,有助于下一步在样品初筛中检出相似未知类似物。研究方法:蛋白同化制剂是具有环戊烷骈多氢菲结构的一类药物。该类药物分子极性较弱,在ESI和APCI源中不容易电离,使用液质联用的方法检测效果较差;蛋白同化制剂在衍生化之后使用气质联用的方法检测效果比较理想,气质联用的方法是目前检测该类药物的主要手段。本实验使用的是GC/MS/MS的仪器方法。1、仪器条件实验使用的仪器为Thermo TSQ9000。柱子初始温度为140℃,三个升温梯度分别以40.0℃/min从140℃升温到180℃;以3.0℃/min从180℃升温到230℃;再以40.0℃/min从230℃升温到300℃,并在这个温度上保持4 min。色谱柱为HP-5MS的毛细管柱（33m×0.20 mm i.d×0.33μm）,氦气为载气,氩气为碰撞气体,使用EI源（70eV）,分流比为5.0的分流模式进样。2、样品的制备使用十万分之一分析天平精确称量1.0 mg左右标准品,根据标准品的结构是否含有脂链分别使用乙腈和甲醇溶解配制成1.0 mg/ml的标准溶液,再用相应的溶剂稀释100倍配制成10ng/μl的标准溶液。取10μl10ng/μl的标准溶液在65℃氮吹下蒸干,加入50μl MSTFA/NH4I/1,4-Dithioerythritol后在70℃炉温箱内加热30 min进行衍生化反应。用全扫描的模式对每一个标准品进行采集,质量扫描范围50-650,每针采集时间为23.42min。对采集的120种标准品的质谱碎片进行解析。研究结果:对已经获得标准品质谱中的特征离子、裂解方式、保留时间、分子离子峰强度进行分析归纳结合相关文献得出以下几点规律。1常见特征离子解析1.1 m/z 129离子碎片甾体具有17-羟基的结构,从D环的C-13/C-17和C-14/C-15处断裂;甾体具有3-羟基的结构,从A环的C-1/C10和C-3/C-4处断裂;甾体具有17-羟基和17-甲基的结构从D环的C-13/C-17和C-15/C-16处断裂。以上三种形式都可以产生m/z129离子碎片。1.2 m/z 169离子碎片甾体具有17-羰基的结构,容易从C环的C-8/C14和C-12/C-13处断裂产生m/z 169的离子碎片。1.3 m/z 143离子碎片甾体具有17-羟基和17-甲基的结构从D环的C-13/C-17和C-14/C-15处断裂产生m/z143的离子碎片。此外3-羟基且A环为饱和环,从A环的C-1/C-10和C-4/C-5处断裂也能产生m/z 143离子碎片。1.4 m/z105离子碎片蛋白同化制剂衍生化以后断裂1个甲基和1个[TMSOH]+产生m/z105的离子碎片,同时分子离子（[M]+）容易断裂甲基和[TMSOH]+还会产生[M-15]+、[M-90]?+、[M-105]+三种常见的离子碎片。1.5 m/z 73离子碎片质谱图中会出现丰度较强的m/z73的离子碎片,这些离子碎片的产生是由于[TMS]+的存在。m/z73与甾体结构没有关系,在质谱图分析中可以忽略。2常见裂解方式解析2.1 1,4-二烯-3-羰基的类固醇具有该结构的蛋白同化制剂容易从B环断裂,常见的断裂形式有从C-9/C-10和C-6/C-7处断裂以及C-9/C-10和C-7/C-8处断裂两种形式。2.21-烯-3-羰基类固醇具有该结构的蛋白同化制剂容易从B环断裂,常见的断裂形式有从C-9/C-10和C-5/C-6处断裂以及C-9/C-10和C-6/C-7处断裂两种形式。2.33-羰基且A环的饱和的类固醇具有该结构的蛋白同化制剂容易从A环断裂,常见的断裂形式有从C-1/C-10和C-4/C-5处断裂,且此处断裂产生的离子碎片容易再断裂1个甲基。2.43-羟基且A环的饱和的类固醇具有该结构的蛋白同化制剂容易从A和D环断裂,且[M-15]+、[M-105]+、[M-105-90]+离子碎片明显。此外此类结构还会容易从C-1/C-10和C-2/C-3处断裂,产生[M-43]+和[M-29]+的碎片离子。2.5 4-烯-3-羰基的类固醇具有该结构的蛋白同化制剂[M]+、[M-15]+离子峰明显。此外还容易从C-9/C-10和C-7/C-8处断裂。3蛋白同化制剂结构与分子离子峰分子离子峰是质谱解析中重要的信息。具有3-羰基-4-烯的蛋白同化制剂在衍生化之后有共轭双键形成,分子结构稳定分子离子峰较强;此外蛋白同化制剂成脂后分子离子峰增强。A环与D环为饱和环蛋白同化制剂不稳定分子离子峰较弱。此外蛋白同化制剂中引入甲基分子稳定性下降,例如结构中1、4、7位引入甲基后分子离子峰明显下降;但2位引入甲基分子离子峰并没有下降,例如屈他睾酮和双氢睾酮。4蛋白同化制剂结构与保留时间对于分子质量相同只存在空间异构的蛋白同化制剂它们的质谱离子碎片相同,但保留时间有差异,α位保留时间在前,β位保留时间在后。其中甲基异位相差时间较大（约1 min）,氢原子异构时间相差较小（约0.2 min）左右。研究结论:使用气质联用方法检测蛋白同化制剂的效果较为理想。通过对已采集标准品质谱离子碎片解析总结出的规律,可以反过来解释120种蛋白同化制剂离子碎片的断裂方式。本工作总结出的规律可以对下一步建立筛选方法时选择最适母离子及子离子提供依据;蛋白同化制剂裂解规律在样品检测中的应用,有利于减少假阳性的发生,并对未知类固醇的结构解析提供巨大帮助。