论文部分内容阅读
目的:探讨核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf-2)基因沉默对纳米二氧化硅(nano-SiO2)致人永生化表皮细胞氧化应激损伤的影响.
方法:采用RNA干扰技术构建人永生化表皮细胞(HaCaT) Nrf-2基因缺陷细胞株(HaCaT-SiRNA-Nrf2),以终浓度为2.5、5.0和10.0μg/ml的nano-SiO2(15nm粒径)分别处理HaCaT和HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞24h,MTT法检测细胞活力改变,同时采用ELISA和细胞免疫荧光技术对各浓度组细胞内活性氧(ROS)、8-羟化脱氧鸟苷(8-oHdG)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等氧化应激相关指标进行测定.Western Blotting检测细胞总蛋白和核蛋白中NRF-2的表达水平,同时采用实时荧光定量PCR检测Nrf-2基因mRNA表达水平.
结果:与正常HaCaT细胞相比，HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞内Nrf-2蛋白和mRNA水平均显著降低，其中mRNA水平降低了90.1％。5.0和10.0μg/ml nano-SiO2可引起HaCaT细胞的活力显著降低(P<0.05)，而2.5μg/ml nano-SiO2即可引起HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞活力呈剂量依赖性显著降低，各浓度组HaCaT-S iRNA-Nrf2细胞的活力均显著低于同浓度组的HaCaT细胞.各处理组HaCaT和HaCaT-SiRNA-Nrf2,细胞内ROS,8-oHdG和MDA水平均呈剂量依赖性显著增高，与同浓度组HaCaT细胞相比，HaCaT-S iRNA-Nrfz细胞的增高程度更大，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，nano-SiO2可引起两种细胞内T SOD和GSH-Px的含量呈剂量依赖性降低(P<0.05)，与同浓度组HaCaT细胞相比，HaCaT-SiRNA-Nrf2细胞的降低程度更大，组内差异均有统计学意义。随着nano-SiO2暴露浓度的增高，两种细胞中总NRF-2蛋白和Nrf-2基因的表达水平均呈先增高后降低的趋势，2.5和5.0μg/ml组细胞核内NRF-2蛋白表达水平显著增高。
结论:15nm粒径的SiO2可诱导人永生化表皮细胞发生氧化应激性损伤，Nrf-2基因沉默可通过改变细胞的抗氧化防御能力，显著增加细胞对nano-Sio2的敏感性，而Nrf-2的激活和核转位在调节细胞内氧化一抗氧化体系中起重要作用。