蛋白质类泛素化(neddylation)修饰是一种调节蛋白活性或功能但不介导其被26S蛋白酶体降解的新型蛋白翻译后修饰。Neddylation修饰过程与泛素化修饰过程类似,通过 NEDD8 激活酶 E1(NEDD8-activating enzyme,NAE)、NEDD8 耦联酶 E2(NEDD8-conjugating enzyme)和 NEDD8 连接酶 E3(E3 ligase)组成的三级酶促反应将泛素样小分子NEDD8共价结合到目标蛋白上。在被NEDD8修饰的底物中,目前对Cullin-RING ligases(CRLs)E3泛素连接酶中的Cullin家族蛋白研究最多。小分子化合物MLN4924是新近研发的neddylation信号通路中NAE的抑制剂。MLN4924作为一个腺苷氨基磺酸衍生物,经过NAE催化形成MLN4924-NEDD8复合物,抑制NAE酶活性,因此被广泛应用于neddylation信号通路生化功能及其调控生物学过程的相关研究。许多癌细胞通过提高糖酵解的速率来产生更多的能量来适应其生长增殖的需求。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)将磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)转变成丙酮酸,是糖酵解过程中重要的限速酶。其中PKM基因编码产生PKM1(pyruvate kinase M1)和 PKM2(pyruvate kinase M2)两个蛋白,PKM2 是癌细胞中PK的主要存在方式,越来越多的研究表明PKM2在癌细胞调控能量代谢中发挥着重要作用。在多种癌细胞中都存在着neddylation修饰的异常活化和能量代谢的失调,但neddylation修饰是否会影响细胞代谢仍然是未知的。为了探究neddylation对乳腺癌细胞的整体代谢水平是否有影响,我们用MLN4924处理MDA-MB-231细胞,用基于质谱-色谱联用的非靶向代谢组学技术分析样品,发现经过MLN4924处理后,细胞提取物中3-磷酸甘油酸和丙酮酸显著增加,提示neddylation信号通路被抑制后,细胞内糖酵解活动增强。MLN4924处理细胞之后,检测发现糖酵解代谢过程中的原料葡萄糖消耗增多、重要的中间代谢物丙酮酸和产物乳酸的量均增多,进一步说明MLN4924处理后细胞糖酵解活动增强。为了探索MLN4924是通过什么方式使糖酵解活动增强,测定MLN4924处理后细胞的PK活性,发现细胞PK活性明显增强,且是时间和剂量依赖的,而敲除PKM2之后,PK活性显著降低,提示PK活性主要表示的是PKM2活性。为了进一步明确MLN4924影响PKM2活性的作用机制,通过戊二醛交联免疫印迹法发现MLN4924处理后,PKM2的同源四聚体活性形式水平增高,提示MLN4924促进PKM2的同源四聚化,使PKM2活性增强。同时用原核表达纯化得到的PKM2蛋白进行体外生化实验,也证实MLN4924能增强PKM2活性。更重要的是,敲低PKM2能显著增强细胞对MLN4924的敏感性,联用MLN4924和糖酵解的特异性抑制剂shikonin能够显著增强MLN4924对癌细胞生长和克隆存活的抑制作用。综上所述,MLN4924抑制蛋白neddylation修饰,诱导PKM2同源四聚体的形成激活PKM2,从而促进糖酵解活动,抑制糖酵解活动能增强乳腺癌细胞对MLN4924的敏感性。因此,我们的研究将neddylation修饰和能量代谢中的糖酵解活动联系到一起,为临床上联用neddylation修饰抑制剂和糖酵解抑制剂治疗癌症这一新的治疗策略提供了重要的理论依据。