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目的:通过检测CDC25A、CDC25B、SMAD3和TGF-β1在食管鳞癌中的表达,探讨青蒿琥酯抗食管癌作用机制。为食管癌治疗寻找新的药物。方法1实验标本采取食管癌、癌旁食管黏膜、手术切缘正常食管黏膜组织1.1采用RT-PCR方法检测44例术中取的新鲜的食管癌、同个体癌旁食管黏膜和手术切缘正常食管黏膜组织中CDC25A、CDC25B、SMAD3和TGF-β1的mRNA表达,44例术中所取的标本均通过病理学诊断证实。经Gel-proAnalyzer3.1软件分析RT-PCR产物的光密度(optical density,OD),计算CDC25A、CDC25B、SMAD3和TGF-β1 OD值与内参照基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GADPH)OD值的比值,作为目的基因产物mRNA的相对含量。1.2采用流式细胞术检测58例原发性食管鳞癌和正常食管黏膜组织的细胞周期、凋亡和CDC25A、CDC25B、SMAD3蛋白的表达,其中蛋白的表达量用平均荧光强度(均道值)来表示。所取的标本均通过病理学诊断证实。2青蒿琥酯抗食管鳞癌作用机制的研究裸鼠移植人食管癌模型建立: 30只裸鼠随机分为五组,在每只裸鼠的左前上肢注射200μl6×106.200μl-1 Eca109细胞。一周后成瘤,瘤体大小平均为0.4mm3,开始用药,腹腔注射,两个疗程,每个疗程一周,从用药日开始每日测裸鼠的体重和瘤体的大小,并观察裸鼠的一般情况。第一组青蒿琥酯100mg.kg-1,第二组青蒿琥酯200mg.kg-1,第三组青蒿琥酯300mg.kg-1,第四组顺铂阳性对照组顺铂3mg.kg-1,第五组生理盐水阴性对照组。每日腹腔注射一次,连续七天为一疗程,休息五天后继续第二疗程,用药两个疗程结束后,停药的第二天,断颈法处死裸鼠,剥离瘤结节,测量移植瘤的长径、短径及瘤重,按下面的公式计算瘤体体积和肿瘤生长抑制率,并将部分标本放入液氮保存,用于分子生物学检测,部分标本固定于70%乙醇,用于形态学观察和流式细胞术检测。肿瘤体积=1/2长径×短径2。肿瘤生长抑制率=(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%。采用流式细胞术检测裸鼠移植瘤组织的细胞周期、凋亡和CDC25A、SMAD3蛋白的表达。采用RT-PCR方法检测裸鼠移植瘤组织中CDC25A、CDC25B、SMAD3、TGF-β1mRNA的表达水平,GAPDH作为内参。3应用SPSS11.5软件进行统计学处理。实验数据以均数±标准差( x±s)表示,不同组别实验数据比较采用方差分析(ANOVA),进一步两两比较采用t检验(LSD法);以α=0.05为检验水准,当P<0.05时具有统计学意义。结果1.食管不同病变组织CDC25A、CDC25B、SMAD3和TGF-β1的mRNA表达情况正常食管黏膜组织、癌旁组织、癌组织中CDC25AmRNA相对表达量分别为0.426±0.210、0.494±0.205、0.705±0.185,CDC25A mRNA在三组之间表达呈上升趋势(P<0.05)。CDC25B mRNA相对表达量分别为0.3832±01440、0.4550±0.1744、0.5802±0.4188,CDC25BmRNA在三组之间表达呈上升趋势(P<0.05)。SMAD3 mRNA相对表达量分别为0.623±0.281、0.613±0.278、0.479±0.251,SMAD3 mRNA在三组之间表达呈下降趋势(P<0.05)。TGF-β1 mRNA相对表达量分别为0.5963±0.2437、0.5592±0.2575、0.4555±0.1585,TGF-β1 mRNA在三组之间表达呈下降趋势(P<0.05)。2.用流式细胞术检测食管不同病变组织的细胞周期和凋亡食管癌组织的凋亡率小于食管正常组织(P<0.05)。食管正常黏膜凋亡率为(9.53±2.26)%,食管癌组织的凋亡率为(8.10±3.57)%。食管正常黏膜组织G1期高于食管癌组织(P<0.05)。食管正常黏膜组织G1期值为:(86.27±3.72)%,食管癌组织G1期值为:(75.07±11.01)%。食管正常黏膜增殖指数小于食管癌组织(P<0.05)。食管正常黏膜增殖指数为:(14.49±3.83)%,食管癌组织增殖指数为(24.92±11.01)%。3.用流式细胞术检测食管不同病变组织中CDC25A、CDC25B和SMAD3蛋白表达情况CDC25A、CDC25B和SMAD3蛋白表达趋势同其相对应的基因表达趋势相一致,即CDC25A、CDC25B蛋白的表达在食管癌组织中高表达(P<0.05),SMAD3蛋白的表达在食管癌组织中低表达(P<0.05)。4.青蒿琥酯(artesunate,Art)抑制裸鼠Eca109细胞移植瘤组织生长作用各实验组肿瘤的体积及重量均明显小于对照组(P<0.05), 100 mg.kg-1、200 mg.kg-1、300 mg.kg-1青蒿琥酯组肿瘤的体积分别为(0.66±0.29)cm3、(0.28±0.22)cm3、(0.61±0.38)cm3 ,肿瘤的重量分别为(0.66±0.27)g、(0.37±0.16)g、(0.65±0.19)g ,顺铂组肿瘤的体积为(0.21±0.07)cm3,肿瘤重量为(0.33±0.05)g,生理盐水对照组肿瘤的体积为(1.00±0.30)cm3,肿瘤重量为(0.94±0.31)g。各青蒿琥酯组体积抑瘤率分别为34%、72%、39%,重量抑瘤率分别为29.79%、60.64%、30.85%,顺铂组体积抑瘤率为79%,重量抑瘤率为64.89%。5.食管癌荷瘤裸鼠动物模型中CDC25A、CDC25B、SMAD3、TGF-β1 mRNA的表达情况各组CDC25A mRNA的表达量:第一组值为0.8383±0.0454,第二组值为0.7300±0.0583,第三组值为0.8517±0.0483,第四组值为0.6850±0.1436,第五组值为0.9650±0.0635。显示青蒿琥酯组和顺铂组CDC25A值低于生理盐水阴性对照组,青蒿琥酯200mg.kg-1组下调CDC25A mRNA作用是青蒿琥酯三组中最强的。各组CDC25B mRNA的表达量:第一组值为0.5036±0.0041,第二组值为0.4556±0.0353,第三组值为0.5024±0.0047,第四组值为0.4406±0.0354,第五组值为0.5389±0.0407。显示青蒿琥酯组和顺铂组CDC25B值低于生理盐水阴性对照组,青蒿琥酯200mg.kg-1组下调CDC25B mRNA作用是青蒿琥酯三组中最强的。各组SMAD3mRNA的表达量:第一组值为0.7865±0.0421,第二组值为0.8909±0.0832,第三组值为0.7915±0.0582,第四组值为0.8914±0.0410,第五组值为0.6862±0.0518。显示青蒿琥酯组和顺铂组SMAD3值高于生理盐水阴性对照组,青蒿琥酯200mg.kg-1组上调SMAD3 mRNA作用是青蒿琥酯三组中最强的。各组TGF-β1 mRNA的表达量:第一组值为0.6703±0.0193,第二组值为0.7439±0.0546,第三组值为0.6777±0.0284,第四组值为0.7083±0.0628,第五组值为0.6091±0.0405。显示青蒿琥酯组和顺铂组TGF-β1值高于生理盐水阴性对照组,青蒿琥酯200mg.kg-1组上调TGF-β1 mRNA作用是青蒿琥酯三组中最强的。6.用流式细胞术检测食管癌荷瘤裸鼠动物模型中CDC25A、SMAD3蛋白的表达情况CDC25A蛋白的表达情况:第一组为513.5761±18.7518、第二组为470.0678±17.2265、第三组为512.5522±13.3181、第四组为484.5414±25.9349、第五组为552.1977±22.0075。趋势和基因表达的趋势一致。显示青蒿琥酯组和顺铂组CDC25A值低于生理盐水阴性对照组。SMAD3蛋白的表达情况:第一组值为418.2193±11.3027、第二组为454.6632±33.9175、第三组为418.9937±31.1770、第四组为456.5815±37.2966、第五组为371.4166±23.2261。趋势和基因表达的趋势一致。显示青蒿琥酯组和顺铂组SMAD3 mRNA蛋白值高于生理盐水阴性对照组。7.用流式细胞术检测食管癌荷瘤裸鼠动物模型中瘤体组织凋亡和细胞周期情况:流式细胞术检测结果显示:青蒿琥酯使Eca109细胞移植瘤的细胞周期被阻滞在G0- G1期,高达66.3%(P<0.05)。对照组处于S期的细胞多达42.9%,体现了肿瘤细胞生长增殖旺盛的特点。青蒿琥酯使Eca109细胞移植瘤的细胞凋亡率增加高达36.36%。结论1. CDC25A mRNA和蛋白在食管癌组织中表达相一致,均高表达。CDC25B mRNA和蛋白在食管癌组织中均高表达。SMAD3 mRNA和蛋白在食管癌组织中均表达下降。TGF-β1 mRNA在食管癌中表达下降。这些基因和蛋白表达的改变可能是引起食管癌发生的分子机制。2.正常食管黏膜组织的凋亡率和处于G1期的细胞高于食管癌组织,食管癌组织中处于S期的细胞明显高于正常食管黏膜组织,说明食管癌组织增殖比较旺盛。3.从裸鼠的动物模型实验结果中可以得出青蒿琥酯具有抑制裸鼠Eca109细胞移植瘤组织生长的作用。抑瘤作用并不随着药物浓度增加而增大,而是中浓度的青蒿琥酯(200mg.kg-1)的抑制肿瘤组织生长的作用是最强的。4.青蒿琥酯使裸鼠移植瘤的细胞周期被阻滞在G0-1期,使处于S期的细胞减少,说明青蒿琥酯抗裸鼠移植瘤组织生长的作用可能与细胞周期阻滞有关。5.从裸鼠的动物模型实验结果中可以得出青蒿琥酯可以上调肿瘤组织中SMAD3和TGF-β1的mRNA和蛋白的表达。下调CDC25A和CDC25B的表达。提示青蒿琥酯抗食管癌的作用机制可能与调节CDC25A、CDC25B、SMAD3、TGF-β1的表达有关。