引言 2006年,在我国许多地区的北京鸭发生以脾脏坏死为特征的雏鸭呼肠孤病毒感染,并引起雏鸭不同程度发病和死亡。目前该病在我国大部分地区均有发生,给养鸭业造成了严重的经济损失。现阶段,对于该病的诊断主要依据临床剖检、病毒分离和病毒基因的检测,缺乏较为稳定和简便的免疫学检测方法。本研应用鸭呼肠孤病毒作为免疫原免疫小鼠,成功制备和获得能稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并以此单抗为基础建立了单抗阻断ELISA方法用于血清抗体的的检测,为鸭呼肠孤病毒的血清流行病学调查以及疫苗的评价奠定基础。材料与方法小鼠免疫及杂交瘤细胞的制备用本实验室分离到的鸭呼肠孤病毒感染鸭胚成纤维细胞,收集感染细胞经经高速离心和超速离心浓缩后制备病毒抗原免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,利用间接ELISA检测小鼠血清的抗体水平,当抗体水平达到1:10000以上时,进行加强免疫,3天后,取小鼠脾脏,将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA和间接免疫荧光筛选阳性克隆,进行三次亚克,获得能稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体的制备及鉴定按常规方法将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔,然后进行腹水的收集和纯化。通过间接ELISA方法与噬斑减数中和试验测定腹水的效价。用间接免疫荧光、免疫组化、Western Blot对单克隆抗体的特异性进行鉴定,并利用Southernbiotech鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒进行抗体亚类分析。结果与讨论本研究筛选出1株能够稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒的杂交瘤细胞,并命名为2F4,细胞上清的效价分别为1:3.2×103,腹水的效价分别为1:3.2×105,经硫酸铵法纯化后效价为1:1.6×105。经中和试验测定其不具有中和鸭呼肠孤病毒的活性。用Southernbiotech鼠单抗亚类分型试剂盒鉴定此株单抗为IgG2a亚型,轻链为Kappa链。免疫组化检测和间接免疫荧光试验表明,此株单抗可与胞浆内病毒结合,产生绿色的特异性荧光。与禽呼肠孤病毒S1133无交叉反应。经Western Blot鉴定,此单抗与34Kd左右的病毒蛋白反应。根据病毒编码蛋白的大小推测为病毒对δC蛋白。利用表达质粒pET-32a作为载体表达表达病毒δC蛋白并进行Western Blot鉴定结果进一步表明此株单抗是针对鸭呼肠孤病毒的δC蛋白。以此单抗为基础初步建立阻断ELISA结果表明,该方法可用于鸭血清呼肠孤病毒抗体的检测,检测条件的优化正在进行中。结论本研究利用鸭呼肠孤病毒全病毒作为免疫原,采用间接ELISA和免疫荧光染色方法进行筛选获得1株能稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒δC蛋白特异性抗体杂交瘤细胞。该单抗可用于病毒抗原的免疫组化检测,并可以此为基础建立阻断ELISA用于血清抗体的检测。