【摘 要】
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日粮蛋白质在瘤胃微生物所分泌酶的作用下,被逐步分解成寡肽、二肽、氨基酸和氨,氨容易被瘤胃吸收并排泄.过量氨的产生导致日粮蛋白利用率和微生物蛋白合成效率降低,而寡肽降解为二肽的过程是肽降解的第一步.二肽基肽酶Ⅳ (Dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ,EC 3.4.14.5)作为寡肽降解的关键酶,研究其基因特征和酶学性质,有助于寻找抑制靶点,降低二肽的生成速度,进而降低氨生成,有
【机 构】
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中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;内蒙古民族大学动物科技学院,通辽028000
【出 处】
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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会
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日粮蛋白质在瘤胃微生物所分泌酶的作用下,被逐步分解成寡肽、二肽、氨基酸和氨,氨容易被瘤胃吸收并排泄.过量氨的产生导致日粮蛋白利用率和微生物蛋白合成效率降低,而寡肽降解为二肽的过程是肽降解的第一步.二肽基肽酶Ⅳ (Dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ,EC 3.4.14.5)作为寡肽降解的关键酶,研究其基因特征和酶学性质,有助于寻找抑制靶点,降低二肽的生成速度,进而降低氨生成,有利于提高氮的利用效率.采用元基因组学的序列筛选方法研究瘤胃微生物DPP-Ⅳ的序列特征和酶活性.选取瘤胃微生物Fosmid文库中17 664个克隆,通过筛选池的方法,利用dpp-Ⅳ简并引物筛选含dpp-Ⅳ的阳性克隆.提取阳性克隆的质粒,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切,然后对阳性克隆的Fosmid末端进行测序.PCR扩增阳性克隆的保守区,进行克隆测序,利用Bioedit软件对序列进行比对.提取阳性克隆胞内蛋白液,利用底物Gly-Pro-pNA检测阳性克隆的肽酶活性.从瘤胃微生物Fosmid文库中通过序列筛选获得10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆(命名为DP1-DP10),HindⅢ酶切图谱表明筛选得到了10个不同的阳性克隆.Fosmid末端序列经blastx比对后发现其与数据库的匹配度较低,其中DP8F和DP10R的末端序列分别与Prevotella ruminicola 23和Muricauda ruestringensis的DPP-Ⅳ相似性达到78％和60％.对8个阳性克隆序列比对后,发现均含有DPP-Ⅳ保守区域(DWVYEEE)和C端催化区域.C端催化区域存在3种类型,其中DP2、DP8和DP10的催化区域为GWSYGG、DP4和DP6为GWRYGG,DP3、DP5和DP7为GWTYGG.经blastp比对,发现DPP-Ⅳ与Cyclobacterium marinum、Capnocytophaga sp.、Prevotella ruminicola 23和Solitalea canadensis来源的DPP-Ⅳ相比,相似度较高(43％ ～81％).经酶活力检测,发现DP7肽酶活力最高,为6.88 U/mg,依次是DP6和DP5,DP2最低.结果提示本文从瘤胃Fosmid文库17 664个克隆中获得了10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆,它们具有不同的基因特征和酶活力大小,暗示DPP-Ⅳ某些氨基酸残基的替换会抑制酶活力.下一步将通过dpp-Ⅳ定点突变结合酶活力检测的方法,寻找与酶活力显著相关的某些氨基酸残基.
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