【摘 要】
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日本脑炎是一种人畜共患的病毒性传染病,日本脑炎病毒反向遗传,特别是感染性克隆,是一个在构建疫苗候选目标,研究病毒致病机理等病毒学研究多个领域都极具应用价值的工具
【出 处】
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上海市畜牧兽医学会2013年学术年会
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日本脑炎是一种人畜共患的病毒性传染病,日本脑炎病毒反向遗传,特别是感染性克隆,是一个在构建疫苗候选目标,研究病毒致病机理等病毒学研究多个领域都极具应用价值的工具.但是,病毒的基因组序列或者编码的某个蛋白对宿主细胞存在毒性影响了病毒cDNA的构建.为了避开这个问题,我们建立了一套以PCR为基础的构建JEV全长cDNA的方法.本实验中,首先将病毒的全基因组分成三个重叠的区段,分别扩增出来,把这三个片段连接到载体中.以这三个片段为模板,通过融合PCR方法,获得JEV的全长cDNA.以cDNA为体外转录的模板,体外转录获得病毒mRNA,转染BHK-21细胞,拯救JEV病毒.通过生物学特性、分子生物学、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定,并测定恢复病毒的生长曲线和LD50.结果获得了全长cDNA,体外转录获得的病毒RNA,转染BHK-21细胞后,二代恢复病毒可引起明显的细胞病变,间接免疫荧光实验和RT-PCR均为阳性.空斑试验表明拯救病毒与原病毒空斑表型类似；恢复病毒与亲本毒相比在BHK-21细胞上生长更快；恢复病毒的LD50与亲本毒类似.
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