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背景及目的急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是在生物学上和临床上高度异质性疾病,中国AML发病率排名世界前列,在AML年轻患者中中国有较高的死亡率。AML的发病机制尚不完全清楚,阻碍了探索AML的新治疗方法的发展。微小RNA是一种新的短的非编码RNA分子。主要通过miRNA与靶mRNA的3’非编码端(3’-UTR)互补结合的方式进行,以阻碍靶mRNA的翻译或导致靶mRNA降解。因此,miRNAs被认为可能是基因表达的天然调节因子。最新的研究已经证明miRNAs是癌症诊断的潜在的和有希望的工具。一些研究表明microRNA-125b与白血病关系密切。本研究通过在急性髓细胞白血病细胞株Kg1a细胞和HL60细胞中转染microRNA-125b类似物,探讨microRNA-125b在AML中的生物学影响以及可能参与调控的信号通路和分子机制,并为AML治疗提供可能的新的治疗靶点。方法1、人工合成microRNA-125b类似物及阴性对照,不同浓度分别转染人急性髓细胞白血病细胞株Kg1a细胞和HL60细胞,使其在急性髓细胞白血病细胞株中异常高表达。2、采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测细胞增殖情况,细胞的侵袭能力应用Matrigel侵袭实验方法检测,应用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡,采用Annexin v-FITC/PI法。3、蛋白印迹法(Western blot)检测过表达microRNA-125b对TNFα诱导NF-κB信号通路激活相关蛋白:IκB-α蛋白、磷酸化IκB-α蛋白以及胞浆、细胞核内核转录因子p65蛋白表达量变化。4、蛋白印迹法(Western blot)检测microRNA-125b过表达状态下细胞周期蛋白cyclinB、cdc-2、mdm-2及抗细胞凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白p53、Bax表达量的变化。5、所有实验至少重复三次,所有实验结果应用统计学处理以均数±标准差(x±s)表示,实验数据应用SPSS 10.0统计软件处理,分析两组间数据采用学生t检验法,分析三组及以上组间数据采用单因素方差分析(ANOVA),P值<0.05被认为有统计学意义。结果1、转染microRNA-125b类似物后Kg1a细胞和HL60细胞内的microRNA-125b表达水平的改变。qRT-PCR检测结果显示,转染50nM、100nM microRNA-125b类似物及阴性对照48小时后,转染组细胞内microRNA-125b增高明显,较阴性对照组和空白组差异有统计学意义(P<0.001),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。2、转染microRNA-125b类似物对Kg1a细胞和HL60细胞的增殖抑制作用。MTT法检测结果显示:转染microRNA-125b类似物(50nM、100nM)及阴性对照6小时,洗脱转染液,给予新鲜培养液继续孵育细胞48小时后,观察对细胞增殖抑制作用。结果显示,转染组较空白组、阴性对照组细胞增殖明显受到抑制差异,有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。并且随着转染浓度增大,对细胞增殖抑制作用更明显。3、转染microRNA-125b类似物对Kg1a细胞和HL60细胞的侵袭能力的影响。Matrigel侵袭实验结果显示:转染组与阴性对照组和空白对照组细胞迁移率明显下降(P<0.05),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。4、转染microRNA-125b类似物对Kg1a细胞和HL60细胞的细胞周期及细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测结果显示:转染组处在G2/M期细胞的比例和凋亡细胞比例较空白组及阴性对照组明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),且50nM转染组与100nM转染组间差异有统计学意义(P<0.05)。5、在Kg1a细胞和HL60细胞中转染microRNA-125b类似物对TNFα诱导的NF-κB信号通路激活的影响:Western blot结果证实,应用TNFα处理细胞后p-IκB-α增加,IκB-α减少,核内p65增加,胞浆p65减少。在应用TNFα处理细胞细胞之前转染microRNA-125b类似物(50nM、100nM)及阴性对照,转染组较阴性对照组和单纯TNFα处理组,p-IκB-α减少,IκB-α增多,核内p65减少,胞浆中p65增加,差异有统计学意义(P<0.05),且50nM转染组较100nM转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。6、在HL60细胞中转染microRNA-125b类似物对NF-κB信号通路调节的下游的与细胞周期及细胞凋亡相关基因表达的影响:Western blot结果显示,受NF-κB信号通路调控的细胞周期G2/M期相关蛋白cyclinB、cdc-2、mdm-2表达量下降,促凋亡基因Bax、p53表达量增加,抑制凋亡基因Bcl-2表达量减少,转染组与阴性对照组和空白组比较有差异,并有统计学意义(P<0.05),阴性对照组与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。结论1、体外实验证实mi R-125b可以抑制急性髓细胞白血病细胞的增殖和侵袭及迁移能力,发生G2/M期阻滞,促进急性髓细胞白血病细胞的凋亡。2、miR-125b能够有效抑制急性髓细胞白血病Kg1a和HL60细胞增殖,促进凋亡是通过抑制NF-κB信号通路。3、我们的研究为miR-125b在急性髓细胞白血病生物治疗靶点提供了依据。