【摘 要】
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[背景]近年来,精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)分化过程的标记基因被不断探索发现并验证,但是涉及调控SSCs 发生的关键基因却知之甚少.[目的]本试验在前期高通量测序的基础上筛选获得SSCs 候选关键基因并对其功能及调控方式进行详细研究.[方法]利用RNA-seq 技术对ESCs、PGCs(Primordial germ cells)和SSCs 转录本进行
【出 处】
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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会
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[背景]近年来,精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)分化过程的标记基因被不断探索发现并验证,但是涉及调控SSCs 发生的关键基因却知之甚少.[目的]本试验在前期高通量测序的基础上筛选获得SSCs 候选关键基因并对其功能及调控方式进行详细研究.[方法]利用RNA-seq 技术对ESCs、PGCs(Primordial germ cells)和SSCs 转录本进行转录本测序筛选获得SSCs特异表达基因LBC(Genbank 登录号：XM_429585.3).运用生物信息学预测、间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence assay,IFA)标记LBC 基因的表达部位.qRT-PCR 检测成体公母鸡不同组织中LBC 表达情况；体外RA 诱导模型中,分别对LBC 基因进行敲除和过表达处理,荧光倒置显微镜观察不同处理组在诱导过程中细胞形态变化；通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和流式细胞分选法检测雄性生殖细胞在不同分组中标记基因的表达和生成效率.同时在鸡胚孵化过程中通过血管注射方法对LBC 基因进行敲除和过表达处理,研究其在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用；逐次截短法构建不同长度启动子片段,双荧光素酶报告基因检测系统筛选LBC 基因启动子活性核心区域；预测启动核心区域转录因子结合位点,并对其进行点突变检测转录因子对启动活性的影响；通过甲基化和乙酰化处理,分别检测它们对LBC 启动子活性影响及LBC 基因在SSCs 的表达.[结果]LBC 定位于1 号染色体上,CDS 长348bp,编码116 个蛋白氨基酸,属于核质共表达基因.LBC 只在公母鸡性腺中表达,且在睾丸中表达量显著高于其他组织(P<0.01)；RA 诱导模型中,过表达LBC 基因促进SSCs-like(Spermatogonia stem cells like cells)形成,与对照组相比,标记基因SOX2 表达量显著下调,Cvh、Stra8 和integrin α6 表达量显著上升(P<0.01)；而敲除LBC 基因后SSCs-like 生成受阻,与对照组相比SOX2,Cvh、Stra8 和integrin α6 表达量与敲除组结果相反(P<0.01)；鸡胚孵化过程中,过表达LBC 基因后4.5d,鸡生殖嵴的生殖细胞较对照组多,孵化12d 后,intergrin α6+细胞率显著高于对照组；反之,敲除LBC 基因则出现相反的结果；启动子核心区域在转录起始位点上游-247～-2bp,预测核心区域转录因子结合位点HoxA5、SOX10,突变两个位点,前者显著降低LBC 基因转录活性,后者促进程度不显著；甲基化和乙酰化处理后LBC 启动活性升高,在SSCs 中的表达显著增加.[结论]本研究结果表明LBC 基因在转录因子HoxA5 作用下促进鸡SSCs 形成,是SSCs 的新特异性标记基因,为进一步研究SSCs调控机制奠定基础.
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