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研究目的:运动性骨骼肌损伤(Exercise-induced muscle damage,EIMD)是大负荷运动尤其是离心运动后出现的骨骼肌细胞微细损伤。Ca2+在骨骼肌运动中维持细胞膜两侧生物电位,对神经-肌肉传导功能及肌肉兴奋-收缩耦联具有重要意义。针灸作为中医传统疗法之一,近年来有诸多研究探索了其对EIMD的效应与相关机制。本实验拟围绕对骨骼肌胞内Ca2+转运机制的探究,观察大负荷运动及针刺干预对骨骼肌胞质、内质网、线粒体Ca2+浓度、骨骼肌内质网钙泵(SERCA)与线粒体内膜钙单向转运蛋白(MCU)的影响,试图进一步丰富运动性骨骼肌损伤的亚细胞器机制,并为针刺治疗和预防运动性骨骼肌损伤提供理论依据。研究方法:(1)对象与分组:健康雄性8周龄SD大鼠88只随机分为对照组(C组,n=8)、运动组(E组,n=40)和运动针刺组(EA,n=40),其中E组和EA组根据干预后不同时相,又分为0h/12h/24h/48h/72h各5个亚组。(2)运动方案:参照Armstrong离心运动方案予以大鼠一次大负荷运动,建立EIMD模型。E组和EA组在正式实验前进行适应性训练3d,第1d跑台坡度0°,速度16m/min,运动时间5min;第2d跑台坡度0°,速度16m/min,运动时间10min;第3d休息。适应性训练后开始正式实验,大鼠在跑台上进行一次持续性下坡跑,坡度-16°,速度16m/min,运动时间90min。(3)针刺方案:运动后即刻对EA组大鼠施针。用直径0.25mm的针灸针沿大鼠小腿三头肌的纵向从远端斜刺穿过肌腹,进针角度约30°,留针2min。(4)样本制备:按照各组对应时相,将大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg体重)麻醉,腹主动脉取血,迅速分离比目鱼肌,用刀片去除两侧肌腱和结缔组织。首先将分离出的比目鱼肌切成小块,冻存管分装,-80℃保存;然后OCT包埋约3mm×3mm×5mm组织,-80℃保存。(5)指标检测:荧光染色(TMEM)法测定骨骼肌内质网Ca2+,酶联免疫吸附(ELISA)法测定骨骼肌SERCA含量,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测骨骼肌MCU、MICU1蛋白表达。研究结果:(1)运动后骨骼肌胞质、内质网、线粒体Ca2+浓度、SERCA与MCU、MICU1变化(1)胞质Ca2+浓度:与C组相比,E组胞质Ca2+浓度总体呈上升趋势。(2)内质网Ca2+浓度:与C组相比,E组内质网Ca2+浓度总体呈降低趋势。(3)线粒体Ca2+浓度:与C组相比,E组线粒体Ca2+浓度呈上升趋势。(4)SERCA变化:与C组相比,E组运动后不同时相SERCA含量呈先降低然后逐渐升高的趋势,干预后0h、12h和24h非常显著低于C组。(5)MCU、MICU1变化:与C组相比,E组MCU、MICU1表达呈先升高后降低的趋势,12h和48h非常显著高于C组。(2)针刺后骨骼肌胞质、内质网、线粒体Ca2+浓度、SERCA与MCU、MICU1变化(1)胞质Ca2+浓度:与C组相比,EA组干预后各时相呈先降低后升高的趋势,干预后0h和12h显著高于C组。与E组对应时相相比,EA组胞质Ca2+浓度均有所降低,其中在干预后0h和12h显著性差异。(2)内质网Ca2+浓度:与C组相比,EA组干预后各时相呈先降低后升高的趋势,干预后即刻显著低于C组并降至低峰。与E组对应时相相比,EA组内质网Ca2+浓度均有所升高,其中在干预后48h具有明显差异。(3)线粒体Ca2+浓度:与C组相比,EA组干预后各时相呈先降低后升高的趋势,干预后12h显著高于C组。与E组对应时相相比,EA组线粒体Ca2+浓度均在有显著性降低,其中干预后0h、12h、24h和48h皆具差异。(4)SERCA变化:与C组相比,EA组呈先降低后升高的趋势,干预后0h、12h和24h非常显著低于C组。与E组对应时相相比,EA组SERCA含量均有所升高,其中干预后48h和72h具有显著性差异。(5)MCU、MICU1变化:与C组相比,EA组呈先升高后降低的趋势,干预后0h、12h和24h非常显著低于C组。与E组对应时相相比,EA组MCU、MICU1含量均有所降低。研究结论:(1)运动后骨骼肌胞质和线粒体Ca2+浓度呈上升趋势,而内质网Ca2+浓度下降,SERCA含量呈先降低然后逐渐升高的趋势,MCU、MICU1表达呈先升高后降低的趋势。(2)针刺可使运动后骨骼肌胞质和线粒体Ca2+浓度下降,内质网Ca2+浓度上升,上调SERCA蛋白的表达,而使MCU、MICU1蛋白的表达减少。(3)针刺改善EIMD可能是通过上调SERCA蛋白表达,减少MCU、MICU1蛋白的表达,进而有效调节骨骼肌胞内Ca2+转运来实现。